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微管(MT)是细胞骨架的主要组成元件之一，其基本组成单位是微管蛋白(tubulin)。微管具有动态不稳定性，且参与细胞的许多生命活动过程。在微管结合蛋白(MAPs)的协助下，微管蛋白对非生物胁迫（高盐、高渗、病害等）的耐受性发挥重要的作用，从而应对各种各样的细胞内部和外部刺激。MAPs的异常表达或者错误修饰都有可能会导致微管产生紊乱的现象，并有可能导致一些疾病的发生，如癌症等。MAP65是一类植物所特有的微管结合蛋白。最近在拟南芥中的研究表明，在盐胁迫时敲除MAP65-1会导致微管解聚，而MAP65-1过表达则会增加耐盐性。这些结果表明在植物遭受各种非生物胁迫时MAP65具有调控微管组织的重要作用。在植物中，对拟南芥AtMAP65家族的基因的研究已有相关报道，而对单子叶模式植物——水稻(Oryza sativa)的OsMAP65家族的基因的研究还是很缺乏。因此，开展水稻O.sMAP65家族T-DNA插入突变体的筛选对进一步研究水稻耐逆性的分子机理具有重要的生物学意义。 本实验主要开展了以下几项研究工作:(1)通过半定量RT-PCR技术分析逆境胁迫下水稻OsMAP65家族成员在粳稻品种日本晴中不同部位的表达情况;(2)对水稻OsMAP65相关基因的T-DNA插入突变体进行纯合突变体筛选及鉴定;(3)对筛选出的纯合突变体的表型及农艺性状进行调查分析;(4)对OsMAP65-1的纯合突变体map65-1的有斑的株系(HM-4)进行细胞死亡鉴定、接菌试验及Tail-PCR分析。具体研究结果如下: (1)在高盐和干旱胁迫下，水稻OsMAP65家族成员在粳稻品种日本晴中不同部位的表达情况均不相同。例如，OsMAP65-1在盐处理和PEG6000处理后的表达情况不同，盐处理0h时在水稻的地上部分不表达，但是处理后3h发生诱导表达，持续到6h，9h后表达量则持续降低;PEG6000处理时地上部分则不表达，而地下部分两种处理时该基因则一直有表达，说明这些逆境胁迫处理对该基因都有影响。 (2)利用“双引物法(LP+RP，RP+RB)”和“三引物法(LP+RP+RB)”筛选鉴定从国外购买的水稻OsMAP65基因相关的11种T-DNA插入突变体。鉴定结果:有3个纯合体突变体的株系，分别是map65-1，map65-3，map65-7;有4个杂合的突变体的株系，分别是map65-2,map65-6,map65-8,map65-10。 (3)T-DNA插入纯合突变体map65-1和map65-3在苗期时和野生型粳稻Dongin相比，长势较慢，植株矮小;栽种大田后发现抽穗期的突变体和野生型相比，分蘖数多且株型紧凑;成熟期时突变体虽然有效穗数比野生型多，但是饱实率非常低，几乎全是瘪粒。此外，还发现OsMAP65-1的纯合突变体map65-1有些株系从五叶期时植株叶片上就出现了红褐色斑点，疑似类病斑，并一直持续到成熟期。 农艺性状鉴定结果表明:T-DNA插入纯合突变体与野生型相比较，在分蘖数、有效穗数、主茎穗长这些农艺性状上有极显著提高;在二次枝梗数这个农艺性状方面有显著下降;而在株高、穗抽出度、穗粒数、剑叶长度、千粒重这几个农艺性状方面有极显著下降。在粒长、粒宽、粒厚和剑叶宽度方面没有显著差异。在茎节方面，T-DNA插入纯合突变体与野生型相比较，除了第一茎节是显著下降，其他全是极显著下降。 (4)取OsMAP5-1的纯合突变体map65-1有斑植株的叶片，进行NBT、DAB染色，证明该叶片的细胞发生死亡。同时，对该有斑植株进行接菌试验，发现该有斑植株对白叶枯病菌生理小种P2(PXO86)有一定的抗性。除此之外，对map65-1的无斑株系和有斑株系进行了Tail-PCR分析，检测其T-DNA片段插入数量以及插入位置是否一致。