课题研究背景：　　大脑的重要功能之一是对生物体的行为活动进行调控，而反过来，生物体的行为活动也直接反应大脑的工作状态。为了了解大脑，研究者不仅要求在活体状态下对神经元进行高分辨率观测，而且也希望生物体在被观测的阶段里，能够进行正常的行为活动。所以，在成像技术不断地提高分辨率和速度等性能的同时，科学家们也在积极开改进和革这些成像技术手段，使其进行成像时尽可能小的限制被观测对象的行为活动，以求获得最接近生理状态下的大脑活动的信息。　　近年来微型双光子显微镜的发展为在被研究动物自由活动下直接观察大脑结构和活动提供了工具。然而，若要研制出具有实用价值的微型双光子显微镜面临诸多挑战，其原因在于双光子成像技术本身有着苛刻的条件要求：　　首先，与单光子荧光效应相比，双光子荧光效应的发生概率极小，需要极高峰值功率的飞秒激光作为光源才能得到足有生物成像所需的荧光信号；其次，飞秒激光的传输是一个复杂的，非线性光学效应主导的过程。为了保证飞秒激光的无畸变传输，传播介质有着严格的限制；此外，在一般的生物样本中，相同平均功率和等效激发波长下，一般双光子所激发的光子数比单光子效应激发的光子数少几个数量级，所以每次需要把全部的激光都汇聚在一个微米量级的点来提高激发效率，所以对光学系统的光学性能要求更加苛刻，并且为了得到二维图像，通常需要通过逐点扫描的方式进行成像。　　所以针对上述双光子成像自身特点，微型双光子显微镜需要需要解决如下几个关键技术难题：　　1.如何将飞秒激光有效的导入微型显微镜；　　2.如何在微型显微镜内进行扫描/图像重建；　　3如何在微型显微镜中进行高质量的激光汇聚，高效激发双光子信号。　　4.如何有效的对荧光信号进行收集；　　5.如何使整个系统在动物剧烈运动时仍保持稳定；　　6.在满足前5项条件下，重量是否足够轻，以致尽量小地对动物的活动造成影响；　　课题研究目标：　　基于前人对于微型双光子显微镜研究开发的经验和教训，开发一系列全新的微型双光子显微镜系统，并制定更加完善和稳定的自由活动小鼠神经成像方法。　　课题研究结果：　　首先，本文分需求，制约和配合三个关键点，提出了微型双光子显微镜的设计原则。接着，本文详细汇报了本课题所研制的第一代微型双光子显微镜（FHIRM-TPM1.0）。FHIRM-TPM1.0的优势之处在于：显微镜探头仅重2.15克；具有非常高的时空分辨率（横向0.65μm，轴向3.30μm；40Hz）；是世界上目前唯一一款可以高效的进行GCamP成像的微型双光子显微镜；能够实现超高速随机扫描（random scan）和高达10,000 Hz的线扫描（line scan）；FHIRM-TPM1.0在实际的行为学实验中展示出了极高的性能和稳定性：在小鼠进行剧烈的行为活动，比如扭动头部或进行社交行为时，仍可以进行长达数小时的神经元单树突棘水平的成像。　　最后，本文介绍了本人目前在研项目，包括：新一代的微型双光子显微镜；全新的高性能微型成像平台—TEACH；Z轴扫描的几种方案；自适应光学微型系统等　　结论：　　理论方面，归纳了现有微型双光子的技术分类和特点，指出了各技术路线中各指标存在的制约关系，提出了微型双光子显微镜的设计原则。技术方面，本课题所研发的微型双光子显微镜技术克服了先前限制微型双光子应用的多种障碍，实现了高时空分辨率，良好的机械稳定性，以及对应用范围最广的指示剂的有效激发，并进一步研制了全新的高性能微型成像平台。实验方面，实现了在自由活动的动物中单突触水平的长时间成像这一科学家梦寐以求的目标。希望在可以预见的未来，我们所研发的新型微型双光子显微镜技术能成为神经科学家以及生物医学科学家在动物体内探索健康和疾病机制的重要工具。