目的:　　 子宫内膜异位症((Endometriosis，简称EMs，内异症)以子宫内膜腺体和间质的宫腔外生长为特征，是育龄妇女的常见病、多发病。内异症可以导致腹痛、低生育力、不孕并有恶变潜能，并影响6-10％的育龄期妇女。内异症复发率较高，可以深部侵袭腹膜、卵巢及肠壁和迁移至远隔组织，是一种具有恶性生物学能力的良性病变。迄今为止内异症的发病机理仍未阐明。“经血逆流学说，是内异症发病机制的经典学说，认为内异症的发病是子宫内膜碎片通过逆流的经血经由输卵管到达盆腔而形成的异位病灶。但经血逆流发生率(80％-90％)远高于内异症发病率，而且有研究证实，内异症患者和正常妇女之间的经血逆流的发生率无统计学的差异，这提示内异症的发病机制可能是多因素的，激素环境，遗传易感性，免疫紊乱，环境因素等都可以促使EMs的发生。“在位内膜决定论”认为，在位内膜特殊的生物学特性与内异症的发病相关，这可能与其基因表达的紊乱有关，但确切的机制仍需证明。　　 microRNAs(miRNAs)是一类内源性表达的，高度保守的非编码小RNA，其基本作用是调节基因的翻译过程。目前普遍接受miRNA在多种基本生理过程中起到作用，例如生长、分化、增殖和凋亡。有研究表明，miRNA通过调节其广泛的靶基因改变子宫内膜的生理及生物学特性，miRNA表达失调，可能引起大量相关基因的表达异常，导致细胞功能紊乱，因此EMs患者miRNA表达谱差异可能是其发病的主要原因，并最终将控制疾病的发生。microRNA-126(miR-126)是筛查出的表达下调的microRNA之一，促进细胞生长，分化，细胞迁移，粘附，侵袭和血管生成等众多生命活动。根据生物信息学分析的结果miR-126通过转录后调控一系列与EMs相关基因的翻译过程，使其蛋白产物表达量发生变化，从而改变子宫内膜的生理及生物学特性。　　 另外大量临床和基础研究证实:内异症是一种细胞功能紊乱的雌激素依赖性疾病。研究表明，雌激素水平不仅可以导致部分miRNA表达谱的变化，而且部分miRNAs的靶基因与雌激素的敏感性和调节作用相关。　　 根据经血逆流学说，粘附、侵袭、血管形成是内异症发病的基本过程。那么miR-126是否与这些生物学行为密切相关，并在内异症的发生和发展过程中起到什么样的作用？本研究将首次探讨miR-126在内异症发病机制中的作用。　　 方法：　　 一、miR-126对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞生物学活性的影响　　 1、原代培养在位内膜间质细胞及正常内膜间质细胞。　　 2、免疫细胞化学染色鉴定细胞。　　 3、瞬时转染技术靶向改变ESC/NSC中miR-126的表达:使ESC中miR-126表达升高，NSC中miR-126表达降低。　　 4、实时荧光定量PCR检测ESC/NSC转染前后miR-126的表达水平变化。　　 5、CCK-8细胞增殖实验检测miR-126表达改变前后细胞增殖的变化。　　 6、应用AnnexinV/EGFP凋亡检测试剂盒检测miR-126表达改变前后细胞凋亡的改变。　　 7、Transwell细胞侵袭实验检测miR-126表达改变前后细胞侵袭能力的改变。　　 8、酶联免疫吸附试验检测miR-126表达改变前后fas/apo-1和sICAM-1在细胞培养上清中的含量变化。　　 9、构建pMIR-ICAM1-3UTR,pMIR-MMP7-3UTR,pMIR-VEGF-3UTR荧光素酶质粒并与miR-126 mimics和pRL-TK海肾荧光素酶质粒共转染ESC。　　 10、利用双荧光素酶报告系统在转染后48小时连续检测萤火虫和海肾荧光素酶活性。　　 11、实时荧光定量PCR检测ESC中miR-126表达改变后ICAM-1，MMP-7，VEGF mRNA的表达水平。　　 12、蛋白免疫印迹检测ESC中miR-126表达改变后ICAM-1，MMP-7，VEGF蛋白表达水平。　　 二、miR-126通过靶基因Crk影响雌激素对子宫内膜细胞增殖效应。　　 1、原代培养在位内膜间质细胞及正常内膜间质细胞。　　 2、瞬时转染子宫内膜间质细胞后，雌激素干预细胞。　　 3、实时荧光定量PCR检测雌激素干预细胞前后miR-126和Crk mRNA的表达水平。　　 4、蛋白免疫印迹检测雌激素干预细胞前后Crk蛋白表达水平。　　 5、CCK-8细胞增殖实验检测雌激素干预及miR-126表达改变前后细胞增殖能力的变化　　 6、构建pMIR-Crk-3UTR/pMIR-Crk-MUT荧光素酶质粒并分别与miR-126mimics和pRL-TK海肾荧光素酶质粒共转染ESC。　　 7、利用双荧光素酶报告系统在转染后48小时连续检测萤火虫和海肾荧光素酶活性。　　 8、实时荧光定量PCR检测ESC中miR-126表达改变后Crk mRNA的表达水平。　　 9、蛋白免疫印迹检测ESC中miR-126表达改变后Crk蛋白表达水平。　　 三、miR-126及预测靶基因Crk在子宫内膜异位症中的表达　　 1、利用实时荧光定量PCR方法检测miR-126在子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜及正常子宫内膜中的表达。　　 2、利用实时荧光定量PCR方法检测Crk mRNA在子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜及正常子宫内膜中的表达。　　 3、利用蛋白免疫印迹技术检测Crk蛋白在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达。　　 4、miR-126与Crk mRNA及蛋白表达相关性分析。　　 5、miR-126与内异症进程相关性分析　　 结果：　　 一、miR-126对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞生物学活性的影响　　 1、体外成功分离和培养子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)及正常内膜间质细胞(NSC)　　 2、免疫细胞化学染色鉴定结果表明细胞波形蛋白、CD10染色阳性，角蛋白、Ⅷ因子及白细胞共同抗原染色为阴性，证实为子宫内膜间质细胞。　　 3、转染8小时后，荧光显微镜下观察转染FAM标记的小片段RNA的子宫内膜间质细胞，呈现绿色荧光，显示小片段RNA转染入细胞中。　　 4、实时荧光定量PCR结果显示:以随机一例NSC的miR-126相对表达水平为1，转染miR-126 mimics后，ESC中miR-126相对表达水平(3206.1174±982.8878)与转染前相比显著增加(P＜0.05)，转染阴性对照negative control(NC)(0.4747±0.0706)及空白的ESC(0.4835±0.0856)中miR-126表达无明显变化(P＞0.05);在转染miR-126 inhibitors后，NSC中miR-126相对表达水平(0.0901±0.0185)与转染前相比显著下调(P＜0.05)，转染转染阴性对照 inhibitor negativecontrol(iNC)(0.8415±0.1133)及空白的NSC(0.8124±0.0601)中miR-126表达无明显变化(P＞0.05)。　　 5、CCK-8细胞增殖实验:绘制细胞生长曲线显示:从转染miR-126mimics24小时开始，ESC增殖率明显受抑制，转染NC的ESC增殖率无明显变化;而NSC在转染miR-126 inhibitors24小时开始，增殖率显著上调;转染iNC的NSC增殖率无明显变化。　　 6、Annexin V-EPGF/PI凋亡检测试剂盒检测结果显示正常状态下，ESC凋亡率显著低于NSC(P＜0.01);转miR-126 mimics后ESC凋亡率显著上升(P＜0.01)，转染NC的ESC凋亡率无显著变化(P＞0.05);NSC在转染miR-126 inhibitors后凋亡率显著下降(P＜0.05)，转染iNC的NSC凋亡率无明显变化(P＞0.05)。　　 7、细胞侵袭实验结果显示正常状态下，ESC侵袭能力显著高于NSC(P＜0.01);转染miR-126 mimics后ESC侵袭能力显著下降(P＜0.01)，转染NC的ESC侵袭能力无显著变化(P＞0.05);NSC在转染miR-126 inhibitors后侵袭能力显著提高(P＜0.05)，转染iNC的NSC侵袭能力无明显变化(P＞0.05)。　　 8、酶联免疫吸附试验结果表明自然状态下，ESC较NSC分泌更多的fas/apo-1和sICAM-1(P＜0.05)，转染miR-126 mimics后ESC分泌fas/apo-1和sICAM-1较转染前显著减少(P＜0.05)，转染NC的ESC二者的分泌量无显著变化(P＞0.05); NSC在转染miR-126 inhibitors后分泌fas/apo-1和sICAM-1增多(P＜0.05)，转染iNC的NSC对二者的分泌量无显著变化(P＞0.05)。　　 9、构建了克隆ICAM-1，MMP-7，VEGF mRNA3-UTR“seed region”结合区域的荧光素酶报告质粒pMIR-VCAM1-3UTR，pMIR-MMP7-3UTR和pMIR-VEGF-3UTR。　　 10、pMIR-MMP7-3UTR, pMIR-VEGF-3UTR和pMIR-VCAM-3UTR转染miR-126后，荧光素酶活性显著低于转染NC及空白对照组(三组基因，P＜0.05)。三者的相对荧光素酶活性在NC转染及空白对照的细胞中没有显著的差异(三组基因，P＞0.05)，并且与pMIR-reporter的相对荧光素酶活性相比没有显著的差异(三组基因，P＞0.05)。　　 11、实时荧光定量PCR分析显示:转染前，ESCs中VCAM-1，VEGF，MMP-7的mRNA表达水平高于NSCs(三组基因，P＜0.001，Fig6 B);与转染前相比，miR-126的变化对VCAM-1，VEGF，MMP-7(m-126 vs ESCs，in-m-126 vs NSCs P＞0.05,Fig6B)水平没有影响。　　 12、蛋白免疫印迹结果显示:转染前，ESCs中VCAM-1，VEGF，MMP-7蛋白表达水平高于NSCs(三组蛋白，P＜0.001)。与转染前相比，m-126组VCAM-1，VEGF，MMP-7蛋白水平显著下调(三组蛋白，P＜0.05)。in-126组VCAM-1，VEGF，MMP-7蛋白水平上升（三组蛋白，P＜0.01），阴性对照组（sNC和iNC组）在转染前后VCAM-1，VEGF，MMP-7蛋白表达没有明显变化(sNC vs ESCs P＞0.05;iNC vsNSCs P＞0.05)。　　 二、miR-126通过靶基因Crk影响雌激素对子宫内膜细胞增殖效应　　 1、细胞转染后24小时，弃去原培养基，然后加入含有雌激素的无酚红的培养基　　 2、实时荧光定量PCR结果显示:与雌激素干预前(ESC:0.5008±0.0507; NSC:0.7966±0.0596)相比，ESCs与NSCs中miR-126表达水平在雌激素干预后下调(E-ESC:0.0890±0.0168, p=0.029, E-NSC:0.4539±0.0618, p＜0.01), Crk mRNA在雌激素干预后表达水平(E-ESC:4.4671±0.6213，E-NSC:2.2498±0.3077)与干预前相比显著增加(ESCs:2.1917±0.3476，p=0.043，NSCs:1.1201±0.1476, p＜0.05)。　　 3、蛋白免疫印迹结果显示ESCs与NSCs中Crk蛋白在雌激素干预后表达水平(E-ESC:1.7095±0.0657;E-NSC:1.4259±0.0644)与干预前相比(ESCs:1.4069±0.0694， p=0.003; NSCs:1.0666±0.0534， p=1.192E-7)显著上调。下调的miR-126的表达与上调的Crk mRNA(r=-0.450，p=2.169E-4)和蛋白(r=-0.393，p=0.001)的表达均呈负相关。　　 4、细胞生长曲线显示:雌激素干预后，细胞增殖率上调（与干预前相比，在所有时间点，P＜0.05）。增加雌激素干预的细胞miR-126的表达，细胞增殖率低于未转染miR-126的E-ESCs，但高于无雌激素干预的细胞增殖率。E-NC组与E-ESCs组细胞相比增殖率没有显著性差异（在所有时间点，P＞0.05）。降低雌激素干预的正常内膜间质细胞miR-126的表达后，细胞增殖率显著上调，E-iNC组的细胞与E-NSCs组细胞相比，增殖率没有变化。　　 5、构建了克隆Crk mRNA3-UTR"seed region"结合区域的荧光素酶报告质粒pMIR-Crk-3UTR。根据种子序列设计的包涵乱序结合位点的DNA片段克隆在pMIR-reporter载体上，构建荧光素酶报告载体pMIR-Crk-MUT，并将其作为特异性对照。　　 6、pMIR-Crk-3UTR荧光素酶活性转染miR-126组显著低于转染NC组(P＜0.001)并低于pMIR-reporter荧光素酶活性(P＜0.001)。pMIR-Crk-3UTR荧光素酶活性转染miR-126显著低于pMIR-Crk-MUT荧光素酶活性(p＜0.001)。pMIR-Crk-MUT相对荧光素酶活性在转染miR-126与转染NC的细胞中没有显著的差异(p＞0.05)，并且与pMIR-reporter的相对荧光素酶活性相比没有差异(p＞0.05)。　　 7、实时荧光定量PCR结果显示:miR-126上调后，Crk的表达水平(2.6633±0.2281)与转染前相比，差异没有统计学意义(2.7656±0.2783，P＞0.05)。miR-126降低后，Crk的表达水平(0.9133±0.1219)与转染前相比，差异没有统计学意义(0.9361±0.1506，P＞0.05)。　　 8、蛋白免疫印迹结果显示:与转染miR-126 mimics前(1.7943±0.0611)相比，miR-126升高后，ESC中Crk蛋白的表达水平显著下调(1.5072±0.0384，P＜0.05)。ESC在转染NC后，Crk蛋白水平没有明显变化(1.8087±0.0583)。与转染miR-126inhibitors前(1.1834±0.0609)相比，在miR-126降低后，NSC中Crk蛋白的表达水平增加(1.4155±0.0587，P＜0.05)。NSC在转染iNC后，Crk蛋白表达水平没有明显变化(1.1938±0.0594，P＞0.05)　　 三、miR-126及预测靶基因Crk在子宫内膜异位症中的表达　　 1、实时荧光定量PCR结果显示正常内膜miR-126相对表达水平为0.4168±0.0527，miR-126在内异症在位内膜中相对表达水平是0.2414±0.0333，miR-126在异位病灶中的相对表达水平是0.06887±0.0107，实验组异位内膜miR-126的表达水平明显低于在位内膜(p＜0.01)，而在位内膜明显低于对照组(p＜0.05)。　　 2、实时荧光定量PCR结果显示正常内膜Crk mRNA相对表达水平为0.7500±0.0637，Crk mRNA在内异症在位内膜中相对表达水平是1.1531±0.1055，CrkmRNA在异位病灶中的相对表达水平是1.1680±0.1196，异位内膜Crk的mRNA表达水平与在位内膜比较无统计学差异(P＞0.05)，而在位内膜明显高于对照组(p＜0.01)。　　 3、蛋白免疫印迹显示以正常内膜Crk蛋白相对表达水平为1.1514±0.0465，Crk蛋白表达水平在内异症组在位内膜的相对表达水平为1.4978±0.0372，异位病灶为1.9461±0.1019，实验组异位内膜Crk的蛋白表达水平明显高于在位内膜(p＜0.01)，在位内膜明显高于对照组(p＜0.01)　　 4、miR-126与Crk表达相关性分析:统计结果显示，miR-126的相对表达水平与Crk的蛋白表达呈负相关(r=-0.464，p＜0.01)，与Crk的mRNA表达无相关性（r=-0.080，p＞0.05）。　　 5、实验组在位内膜及异位内膜miR-126与r-AFS分期及评分高度相关。根据统计学结果，在位内膜及异位内膜中miR-126相对表达水平与r-AFS分期呈负相关(EUs: r=-0.418，p=0.022; ECs: r=-0.556，p＜0.05)，与r-AFS评分呈显著负相关(EUs:r=-0.548,p=0.002, ECs:r=-0.646,p＜0.01)。　　 结论：　　 1、miR-126的下调与ESC更强的细胞增殖能力，更低的细胞凋亡率，更强的迁移和侵袭力、增殖，血管生成及免疫逃逸能力相关。低表达的miR-126通过转录后调节靶基因VCAM-1，MMP-7及VEGF促进内异症的发生。miR-126在ESC与NSC之间的差异表达可能是ESC与NSC存在诸多生物学差异的重要因素。　　 2、雌激素水平的升高抑制miR-126的表达，而表达下调的miR-126可能通过降低对Crk靶向抑制作用促进Crk蛋白的表达，进一步促进雌激素对细胞的增殖能力的影响，参与内异症的发生和发展。miR-126在ESC与NSC之间的差异表达可能是影响雌激素对子宫内膜细胞作用的重要因素。　　 3、miR-126、在子宫内膜异位症在位内膜及异位病灶中表达低于正常内膜，下调的miR-126可能通过靶基因Crk表达的增加促使内异症的发生和发展。