宁夏枸杞叶及花的资源化学研究

来源 :南京中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:roc9055
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本论文分为四个章节,主要归纳如下:第一章文献研究本章通过搜集和整理相关文献,对枸杞叶及枸杞花进行本草考证,并对其化学成分和药理活性研究进展进行系统综述,以期为枸杞叶和枸杞花的资源价值挖掘与产品开发提供参考。第二章宁夏枸杞叶及花资源性化学成分评价与标准建立(一)为明确宁夏枸杞叶及花中资源性化学成分种类及含量,分别采用紫外分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-TQ-MS)等现代分析方法,对宁夏枸杞叶及花中的黄酮及酚酸类、糖类、核苷及氨基酸类、生物碱类成分进行分析评价。结果表明,宁夏枸杞叶及花中总酚酸的含量分别为10.64 mg/g与22.72 mg/g,总黄酮的含量分别为20.18 mg/g与62.36 mg/g;宁夏枸杞叶和花中分别检测到10种和7种酚酸与黄酮类化合物,花中新绿原酸含量相对较高(1.634 mg/g),叶中绿原酸(2.607 mg/g)和芦丁(4.943 mg/g)含量相对较高,且内蒙古地区的样本中绿原酸的含量均显著高于其他三个产地。宁夏枸杞叶中检测到中性多糖(18.99 mg/g)和酸性多糖(18.69 mg/g),花中也检测到中性多糖(22.22 mg/g)和酸性多糖(8.15 mg/g),并且叶和花中均含有果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖,花中果糖(41.87 mg/g)和葡萄糖(47.42 mg/g)含量较高,叶中蔗糖(15.93 mg/g)含量较高,对于不同产地宁夏枸杞叶,来自甘肃省的样品中蔗糖含量显著高于其他三个产地。宁夏枸杞叶含有8种核苷类(总量为53.44μg/g)、12种氨基酸类成分(总量为384.7 μg/g),宁夏枸杞花中含有10种核苷类(总量为2.01 mg/g)、19种氨基酸类成分(总量为17.66 mg/g),叶中所测得的核苷类及氨基酸类成分总含量有青海>甘肃>宁夏>内蒙古的趋势。宁夏枸杞叶中甜菜碱含量(47.83 mg/g)高于花中甜菜碱含量(18.78 mg/g),并且不同产地宁夏枸杞叶和花中甜菜碱含量并无明显差异。(二)基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF/MS)法及正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)探讨果用与叶用宁夏枸杞叶的化学成分差异,鉴定指标性成分。结果表明,芦丁、绿原酸、山柰酚-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷可用于作为区分果用与叶用宁夏枸杞叶的指标性成分。采用高效液相色谱法(HPLC)分别建立果用与叶用宁夏枸杞叶指纹图谱,进行相似度评价,并根据含量测定结果分别为果用与叶用宁夏枸杞叶的质量标准建立提供依据。结果显示,以果用枸杞叶中芦丁含量按平均值1.0365%下浮40%并取整为限,即芦丁含量不得少于0.6%为下限鉴定为果用宁夏枸杞叶;以叶用枸杞叶中绿原酸含量按平均值0.5832%下浮40%并取整为限,即绿原酸含量不得少于0.3%为叶用宁夏枸杞叶。第三章宁夏枸杞叶的资源价值发现及资源化利用研究(一)分别采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除法和Fe3+还原能力(FRAP)法评价宁夏枸杞叶不同提取物的体外抗氧化活性,研究结果表明,宁夏枸杞叶水提物(WL)具有较强的清除DPPH自由基活性,其IC50值为0.017±0.002 mg/mL,枸杞叶醇提物(EL)具有较强的清除ABTS自由基活性,其IC50值为0.351±0.025 mg/mL。在FRAP法中,EL的抗氧化活性最高,为0.020±0.001 mmoL FeSO4.根据上述结果,枸杞叶醇提物的具有较强的抗氧化能力。分别采用过氧化氢致PC12细胞氧化损伤模型及脂多糖致PC12细胞炎症损伤模型,经过药物作用,采用MTT法检测细胞的存活率来评价枸杞叶的神经保护作用。结果显示,对过氧化氢致PC12细胞氧化损伤模型,EL、枸杞叶多糖提取物(DT)均有明显预保护作用,并呈现一定的浓度相关性,在相同浓度梯度下,该作用大小为EL>DT。山柰酚-3-O-芸香糖苷、隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸、芦丁也有明显的预保护作用,其中芦丁的活性最强。对脂多糖致PC12细胞炎症损伤模型,WL、EL提取物在一定浓度下有明显的保护作用,且呈现浓度相关性,而枸杞叶多糖提取物DT的保护作用则较弱,芦丁的保护作用最强。该结果可为枸杞叶的开发应用提供参考。(二)采用高脂饲料联合链脲佐菌素(STZ)建立二型糖尿病(T2DM)大鼠模型,枸杞叶水提物连续给药4周后,收集大鼠血液、尿液、肝脏、肾脏和胰腺组织,分别进行生化指标测定、组织病理学分析。生化指标分析结果显示,模型组血糖血脂、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和尿蛋白水平异常。肝、肾、胰腺病理切片也显示模型组发生明显的病理变化。治疗后血糖血脂、ALT、AST和尿蛋白水平趋于正常,与模型组比较有显著性差异,肝、肾、胰腺病理切片也显示各给药组的病理变化得到改善,提示枸杞叶水提物可不同程度地改善二型糖尿病引起的肝、肾损伤。采用UPLC-QTOF/MS技术,对二型糖尿病大鼠的血清、尿液进行代谢组学分析,寻找差异代谢产物和潜在生物标志物,构建代谢通路并对其进行验证。通过代谢组学分析,在血清和尿液样本中共鉴定出22个潜在生物标志物(血清7个,尿液15个),涉及的代谢途径主要包括泛酸和辅酶a的生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化、烟酸和烟酰胺的代谢、花生四烯酸的代谢等,其中烟酸和烟酰胺代谢被认为是宁夏枸杞叶提取物参与的最重要的代谢途径,其影响值为0.2381。进而采用Western blot法对胰岛素受体转导通路以及花生四烯酸代谢通路进行验证,结果显示,二型糖尿病大鼠肝脏中相关蛋白表达水平紊乱,T2DM大鼠发生胰岛素抵抗和炎症反应。经过药物调节的各组均有不同程度的回调,证实宁夏枸杞叶水提物可通过胰岛素受体转导通路以及花生四烯酸代谢通路改善T2DM大鼠血糖。通过16S rRNA测序技术研究宁夏枸杞叶对二型糖尿病大鼠肠道菌群的多样性的调节作用,结果表明,模型组与正常组之间有45个显著差异的属,在给药后有6个属向空白组方向回调,包括:PrevotellaceaeNK31group,Marvinbryantia,Blautia,Parasutterella,Ruminococcus1和Coprococcus2.肠道菌群代谢通路预测显示,碳水化合物代谢,氨基酸代谢,能量代谢,异常脂质代谢,以及糖生物合成与代谢通路发生紊乱,糖尿病大鼠肠道内环境失去平衡,提示宁夏枸杞叶提取物可缓解T2DM大鼠肠道菌群失调而改善糖尿病。利用R语言,对9个生化指标、22个代谢产物和47个差异菌属计算皮尔逊相关系数的相关矩阵,结果显示,各生化指标,代谢产物和差异菌属之间相互影响,共同影响二型糖尿病的发展。第四章宁夏枸杞花抗氧化及神经保护活性初步研究(一)分别采用DPPH、ABTS自由基清除法和FRAP法评价宁夏枸杞花不同提取物的抗氧化活性,结果表明,枸杞花醇提物(EF)具有较强的清除DPPH自由基活性,其IC50值为0.163±0.007 mg/mL,EF同时具有较强的清除ABTS自由基活性,其IC50值为0.380±0.018 mg/mL。在FRAP法中,EF的抗氧化活性最高,分别为0.021±0.001mmoL FeS04.根据上述结果,枸杞花醇提物具有较强的抗氧化能力。(二)分别采用过氧化氢致PC12细胞氧化损伤模型及脂多糖致PC12细胞炎症损伤模型,经过药物作用,采用MTT法检测细胞的存活率来评价宁夏枸杞花的神经保护作用。结果显示,对过氧化氢致PC12细胞氧化损伤模型,枸杞花水提物(WF)、EF均有明显预保护作用,并呈现一定的浓度相关性,在相同浓度梯度下,该作用大小为EF>WF。对脂多糖致PC12细胞炎症损伤模型,WF、EF提取物在一定浓度下有明显的保护作用,且呈现浓度相关性。该结果可为宁夏枸杞花的开发应用提供参考。
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