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研究背景:先天性巨结肠(Hischsprung’s disease,HSCR)被称为肠道无神经节细胞症,是新生儿常见的先天性消化道畸形,在中国、日本等亚洲地区的发病率较欧美地区高,约为1/4000-1/5000。先天性巨结肠特征性的病理改变是远端结肠肌间及粘膜下缺乏神经节细胞,导致病变肠管长期处于痉挛状态,继而病变肠管的近端出现代偿性肥厚及扩张,临床上出现腹胀、难治性便秘、营养不良以及小肠结肠炎等症状。先天性巨结肠的发生和肠神经嵴细胞在远端肠管的迁移、增殖、分化、存活异常密切相关,但详细的发病机制未完全阐明。现阶段对于HSCR的研究重点仍是各种病变因素如何影响肠神经系统的发育。在遗传学方面,酪氨酸激酶受体(RET)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、内皮素受体β(EDNRB)等基因突变以及相关通路的已经被证实在肠神经系统形成过程中起到关键作用。然而上述基因突变只能解释约一半的家系病例和少部分散发病例,仍有大量未知发病机制尚待深入研究。基因表达还受到其他机制的调节,如DNA修饰、转录机制、转录后机制和翻译调节等。这些表观遗传学机制都可能参与肠神经系统的发育,并导致先天性巨结肠的发生。近年来,表观遗传学在先天性巨结肠中的研究逐渐增多,HSCR的发病机制也被进一步的丰富。有研究表明长链非编码RNA(Long Non-coding RNA,LncRNA)与肠神经嵴细胞的迁移分化密切相关,可能参与HSCR的发生。因此LncRNA在先天性巨结肠的发病机制中的具体作用仍需要更加深入的研究。研究目的:本研究旨在检测先天性巨结肠病变肠管中LncRNA异常表达情况,研究异常表达的LncRNA对神经干细胞生物学行为的调控作用和机制,为进一步研究HSCR的发病机制提供新思路。研究方法:1、先天性巨结肠病变肠管的LncRNA测序。标本来源于2018年12月至2021年7月山东省立医院小儿外科手术治疗30例散发的先天性巨结肠手术切除肠管组织。所有病例标本均经过术后病理科确诊,分为有神经节细胞的扩张段和无神经节细胞的狭窄段。送检9例标本进行LncRNA的测序。LncRNA测序后,获得LncRNA的差异表达谱,选取在狭窄段低表达的LINC00346作为候选研究对象。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)在30例组织中验证上述LINC00346与芯片结果的匹配性。2、体外实验则应用神经干细胞(SK-N-BE(2)和SH-SY5Y两细胞株)作为研究对象,首先通过转染慢病毒敲低LINC00346的表达,应用CCK-8法细胞增殖实验、EDU法细胞增殖实验、Transwell法迁移实验和流式细胞法检测凋亡,分析低表达的LINC00346对神经干细胞的生物学行为影响。3、通过生物信息学与蛋白质谱(Labelfree法)检测,进一步对基因功能、靶基因及信号通路预测分析,构建差异基因共表达网络。预测结果显示LINC00346/miR-148a-3p/DNMT1可能对神经干细胞的增殖、迁移有影响。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)法分别检测在HSCR狭窄段和扩张段中,LINC00346,miR-148a-3p和DNMT1基因的相对表达,以及DNMT1蛋白的表达情况。进而通过双萤光素酶实验验证LINC00346/miR-148a-3p以及miR-148a-3p/DNMT1两两之间的相互关系;然后继续在体外通过转染miR-148a-3p的模拟物(mimics),应用CCK-8法细胞增殖实验、EDU法细胞增殖实验、Transwell法迁移实验和流式细胞法检测过表达的miR-148a-3p对神经干细胞的生物学行为影响;最后在敲低LINC00346的稳转细胞株中加入miR-148a-3p的抑制剂(inhibitor),验证是否对DNMT1的表达起到逆转作用以证实三者之间的相互作用关系。研究结果:1、通过LncRNA测序获得了 LncRNA在巨结肠标本中的差异表达谱。在先天性巨结肠狭窄段病变肠管组织中检测到表达明显上调的LncRNAs1569个,明显下调的668个,其中表达上调超过2倍的LncRNA 640个,表达下调超过2倍的有352个(Fold Change>2,P<0.05)。从狭窄段表达下调的LncRNA选取了 LINC00346作为备选研究LncRNA,并在30对组织中行qRT-PCR验证其表达情况。与扩张段肠管组织相比(n=30),LINC00346在狭窄段肠管组织中呈明显低表达(0.01773940 vs.0.00530242),差异具有统计学意义(P<0.05)。2、CCK-8和EDU实验表明LINC00346的下调降低了神经干细胞的增殖能力;Transwell实验表明LINC00346的下调降低了神经干细胞的迁移能力;流式细胞结果表明LINC00346的下调促进了神经干细胞凋亡。3、与扩张段肠管组织相比,DNMT1在狭窄段肠管组织中呈明显低表达(0.04908 vs.0.01522,P<0.05);miR-148a-3p在狭窄段肠管组织中呈明显高表达(0.06871 vs.0.1666,P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证明miR-148a-3p可以对LINC00346的3’UTR起到抑制性调控作用,存在结合的靶向关系。CCK-8和EDU实验表明miR-148a-3p的过表达降低了神经干细胞的增殖能力;Transwell实验表明miR-148a-3p的过表达降低了神经干细胞的迁移能力;流式细胞结果表明miR-148a-3p的过表达促进了神经干细胞凋亡。通过western blotting实验在LINC00346稳定下调的神经干细胞中加入miR-148a-3p的抑制剂可以部分逆转DNMT1的表达。研究结论:先天性巨结肠狭窄段和扩张段肠管组织检测到大量差异表达的LncRNA,这些差异表达的LncRNA可能与先天性巨结肠的发生和致病密切相关。其中的LINC00346可能通过miR-148a-3p,起到内源性竞争性RNA的作用,进而调控DNMT1的表达,影响神经干细胞的增殖、迁移和凋亡,可能参与先天性巨结肠的发病机制。