研究背景与目的:　　穿膜肽是一类能够穿透细胞膜进入胞质甚至胞核而不破坏胞膜结构的小分子肽其长度一般不超过30个氨基酸。早在1988年,Frankel和Green在研究免疫缺陷病毒(HIV)-1时发现反式激活蛋白Tat具有跨膜功能,即细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides,CPPs)。近年的研究表明,将难进入细胞的生物活性分子与细胞穿膜肽通过化学键连接或物理聚合,能运载一系列的生物活性分子进入细胞内,包括小分子、多肽、蛋白质、质粒DNA和寡核苷酸。该穿膜肽具有转导效率高、毒性低、可修饰性等特点,优于常规的药物运输载体。但其不足之处是缺乏靶向性,严重限制了其在肿瘤治疗中的应用。　　为增强穿膜肽的靶向性,本实验设计了以基质金属蛋白酶(Thematrixmeta-lloproteinases,MMPs)为靶点的发夹状可活化穿膜肽(ACPP),即ACPP的发夹结构由MMP-2/9水解底物构成。MMPs家族是一类依赖锌离子的内肽酶,其主要作用是通过降解基底膜和细胞外基质,促进肿瘤的侵袭和转移。MMPs家族中的MMP-2/9已被证实在多种恶性肿瘤中高表达,但在正常组织中表达微弱。理论上推测,当本实验设计的ACPP到达分泌MMP-2/9的肿瘤细胞时,可活化穿膜肽的发夹状结构可被水解而使穿膜肽由发夹结构变成线性结构,从而发挥穿膜功能。本研究将探讨新合成的ACPP的穿膜效率及肿瘤靶向性,为下一步构建穿膜肽—高分子基因运载系统奠定实验基础,为肿瘤的靶向治疗提供新的方法。　　方法:　　一、多肽的合成和荧光标记:可活化穿膜肽(EEEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRRN)由强耀(上海)生物科技有限公司用固相法化学合成,N端标记FITC荧光素。　　二、荧光显微镜分析:4种肿瘤细胞(HEPG-2、A549、SW480、OVCAR3)和正常对照细胞HBE分别用40umol·L-1、60umol·L-1、80umol·L-1、140umol·L-1、160umol·L-1、180umol·L-1、200umol·L-1的ACPP孵育,观察细胞内的荧光表达情况,选择最佳浓度。用200umol·L-1ACPP孵育,荧光显微镜观察细胞内的荧光表达情况。　　三、流式细胞仪检测:4种肿瘤细胞和正常对照细胞HBE分别与40umol·L-1、100umol·L-1、200umol·L-1ACPP孵育,或者在200umol·L-1的ACPP孵育下,在0.5H、4H、8H、12H、24H的时间梯度,或者取两份200umol·L-1的ACPP分别在4℃和37℃孵育,采用流式细胞仪检测细胞内的荧光强度值。　　四、肝素钠对ACPP入胞的影响:肿瘤细胞HEPG-2、A549、SW480、OVCAR3与肝素钠(终浓度为50umol·L-1)孵育,荧光显微镜观察肝素钠对ACPP穿膜的影响。　　五、MTT法检测ACPP对细胞生长的影响:人肝癌细胞HEPG2分别于40umol·L-1、60umol·L-1、80umol·L-1、140umol·L-1、160umol·L-1、180umol·L-1、200umol·L-1的ACPP孵育0.5h后,酶标仪检测其在570nm的吸光度值。　　六、RT-PCR检测各组细胞的MMP-2、MMP-9mRNA表达情况:采用TRIzol试剂提取细胞总RNA。2％琼脂糖凝胶电泳鉴定,凝胶图像分析软件测量灰度值并进行半定量分析。　　七、Westernblot检测各组细胞的MMP-2、MMP-9蛋白表达情况:按2×107细胞提取细胞总蛋白,经酶标仪定量,单克隆抗体MMP-2/9和β-Actin孵育,最后用ImageJ软件分析。　　八、统计学分析:采用GraphPadPrism5Demo进行统计学分析。所有实验结果以均数±标准差(Mean±SD)表示。两组间比较采用组间t检验,检验水准α=0.05。　　结果:　　一、荧光显微镜检测HEPG-2、A549、SW480、OVCAR3四种肿瘤细胞内部均有较强的绿色荧光反应,说明ACPP具有高穿膜活性,而在HBE细胞内部,几乎看不到绿色荧光反应,说明ACPP具有靶向肿瘤细胞特性。　　二、流式细胞仪检测可见,在HEPG-2、A549、SW480、OVCAR3四种肿瘤细胞中,荧光强度随着ACPP浓度的增加均有上升。100umol·L-1与200umol·L-1组的荧光强度值比40umol·L-1组的明显升高,并有统计学差异(P<0.05);而100umol·L-1与200umol·L-1组间荧光强度值比较虽无统计学差异(P>0.05),但在荧光显微镜下我们发现,肉眼所见200umol·L-1浓度下的荧光强度更明显,因此选择这个浓度为最佳实验浓度。对照组HBE细胞在各浓度的ACPP作用下,细胞内荧光强度没有发生变化。　　三、荧光显微镜检测孵育时间从0.5h到24h,HEPG-2、A549、SW480、OVCAR3四种肿瘤细胞内的荧光强度也发生变化。流式细胞仪检测上述细胞,发现随着时间的推移,肿瘤细胞的荧光强度呈先升高后降低的趋势,HEPG-2、OVCAR3、A549、SW480细胞分别在0.5h、12h、8h、8h达到峰值。而对照组HBE细胞内的荧光强度随着时间的延长,并未发生变化,各个时间段的细胞内荧光强度均较上述肿瘤细胞组低。　　四、选取HEPG2,分别在4℃和37℃观察ACPP的穿膜效率。相比于37℃,在4℃条件下,ACPP的穿膜活性受到显著的抑制(P<0.05)。　　五、HEPG-2、A549、SW480、OVCAR3四种肿瘤细胞在加入肝素钠后,ACPP的摄取均显著降低,细胞内的荧光强度显著下降。　　六、MTT法检测证明,ACPP即使在高浓度下,对细胞活性亦无明显的影响。　　七、RT-PCR及WesternBlot检测结果表明,在HEPG-2、A549、SW480、OVCAR3四种肿瘤细胞中,MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平均高于HBE对照组,其中HEPG2和OVCAR3的MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平与对照组HBE相比存在统计学差异(P<0.05)。　　结论:　　一、ACPP具有明显的肿瘤靶向性和高效的穿膜活性,其穿膜效率与基质金属蛋白酶MMP-2/9的表达呈正向关系。　　二、ACPP穿膜效率具有时间和浓度依赖性,随着时间和浓度的增加ACPP入胞量增加。ACPP对细胞无毒性作用。　　三、ACPP的入胞是一个耗能过程,其与细胞表面硫酸蛋白聚糖结合能力决定了其穿膜效率。