目的：神经细胞属终末分化细胞，神经系统受损伤后无法通过神经细胞的再生而得以恢复。近几年来，通过移植神经干细胞和胚胎干细胞治疗神经系统疾病，已取得了一定的成果。但成人的神经干细胞不易获得，胚胎干细胞来源有限，且异体移植也容易产生排斥反应。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是存在于成年骨髓中的一种干细胞，具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下能分化成中胚层来源的间质细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、网状细胞、血管内皮细胞等。近年的研究显示，MSC的终末分化有可能跨越胚层界限，而向实质细胞转化，如分化为心肌细胞、神经细胞等。MSC易于获得，扩增迅速，移植无免疫排斥反应，可通过血脑屏障，提示MSC有望作为一种理想的种子细胞，在神经系统疾病治疗中发挥重要的作用。 应用MSC进行细胞治疗的关键因素，首先是要获得较高纯度的MSC进行体外扩增，其次是在体外定向诱导分化有较高的转化率，这样才能满足细胞治疗时所需的细胞数量。本研究旨在探索一种分离培养兔骨髓间充质干细胞并诱导其向神经元样细胞分化的有效方法，为骨髓间充质干细胞的进一步研究奠定基础。 方法： 1 MSC的分离培养无菌条件下抽取6月龄雄性新西兰白兔双侧髂骨骨髓，Perc01分离液(相对密度1.073)密度梯度离心，获取骨髓单个核细胞进行培养，通过反复换液，传代培养，得到相对纯化的MSC。每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化。绘制原代、2、5、8代细胞生长曲线。HE染色观察细胞形态。 2 体外诱导MSC分化为神经元样细胞取体外培养扩增的3～6代MSC以1×10<5>/ml的浓度接种于6孔培养板，采用含有1mmol/L β-巯基乙醇、10％胎牛血清的DMEMM培养液预诱导24h，再用含6mmol/L β-巯基乙醇的无血清培养液诱导6h，倒置显微镜下密切观察诱导前后细胞的形态改变，免疫组化测定诱导前后神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况，定量分析。 结果： 1 细胞生长增殖及形态变化PerC01分离液分离后所获细胞主要为圆形单个核细胞，其中混有少量的红细胞，经台盼蓝拒染法测定，活细胞的比例达95％以上。 原代细胞接种后见大量圆形细胞悬浮存在，轮廓清晰，24h后即有少量细胞贴壁，24h～48h贴壁细胞数量逐渐增多，细胞呈现类圆形或不规则形态，胞核质分界清晰，折光性强。接种后3d～4d贴壁细胞明显增多，8d～10d细胞呈集落生长，部分细胞开始拉长，伸出伪足变成短梭形或星形，向周围呈辐射状排列，细胞核较大，胞浆中颗粒较多，呈圆形或椭圆形。12d后贴壁细胞呈长梭形外观，部分区域融合成片。13d～14d细胞融合成单层，呈典型细长梭形外观。但继续培养后细胞可呈多层生长，无明显接触抑制现象。传代细胞于传代接种后12h贴壁，迅速生长，6d～8d爬满瓶底。各代细胞形态基本一致，均为长梭形。 2 培养细胞的生长测定从原代细胞生长曲线上看出，原代培养时间潜伏期较长，一般为4d～5d，8d进入对数生长期，细胞增殖明显加快，14d左右进入平台期，细胞增殖速度趋于平缓。从2、5、8代细胞生长曲线上看出，传代细胞生长潜伏期则只有1d～2d，3d～4d进入对数生长期，持续4d～5d，7d～8d进入平台期。而且随传代次数的增加，细胞的增殖能力有所下降。 3 HE染色光镜观察MSC呈长梭形，多角形等，胞浆粉红色，呈细网状，细胞核深蓝色，位于中央，可见分裂相。 4 体外诱导及免疫组化分析MSC经预诱导液(含1mmol/L β-巯基乙醇、10％胎牛血清的DMEM培养液)预诱导24h后，倒置显微镜下观察到长梭形细胞胞质向胞核收缩，变为不规则形和圆形，少量细胞脱落死亡。加入诱导液(含6mmol/L β-巯基乙醇的无血清DMEM培养液)诱导后，细胞逐渐长出较长的突起，突起继续延长出现一级分支和二级分支，而且折光性增强，呈现神经元样细胞形态。免疫组化分析诱导2h、6h后的神经元样细胞，NSE染色阳性，GFAP染色阴性，诱导6h后NSE染色阳性率为72.6±11.3％。诱导分化前的MSC未检测到NSE及GFAP的表达。 结论： 1 骨髓间充质干细胞能在体外分离、培养、扩增，Percol分离液密度梯度离心后贴壁培养，可获得较高纯度的MSC，原代及传代培养细胞生长稳定，增殖迅速，各代形态均一，呈长梭形细胞形态。 2 β-巯基乙醇可诱导骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞，而不是星形胶质细胞。 3 本实验条件下，细胞生长良好，诱导转化率高，可为间充质干细胞的进一步研究奠定基础。