目的：　　艾滋病是目前对人类社会威胁最大的传染性疾病之一。尽管抗病毒药物已经普遍应用于艾滋病的治疗，但由于HIV-1存在高水平的遗传变异，在抗病毒药物的作用下病毒易出现耐药突变，艾滋病仍无法治愈，艾滋病的防治面临巨大的挑战。从长远策略来说，HIV疫苗是控制艾滋病流行根本途径之一。HLA限制性CTL应答能够有效的控制HIV病毒复制，尤其是HLA限制性Gag蛋白CTL应答的作用最为突出，Gag蛋白已经成为目前以诱导产生广泛CTL反应为基础的疫苗选用的抗原。由于不同人群遗传背景及流行毒株的差异，目前国外发现的一些可能具有保护作用的CTL应答在本人群中不一定起作用，因此寻找我国遗传背景下具有保护作用的免疫应答，对于疫苗的研制有重要的意义。　　HIV-1病毒感染机体后，不同的个体表现出不同的疾病进展状态。影响艾滋病疾病进展的因素相对较多，HIV病毒与宿主免疫应答相互作用是决定艾滋病疾病进展的主要因素，尤其是宿主HLA限制性CTL应答。目前认为宿主HLA等位基因是影响HIV疾病进展的重要的宿主遗传学因素。然而HLA分子具有高度多态性，且不同人群流行的HIV毒株的特征也不一致，使不同人群中HIV病毒特异性免疫应答各异，HLA分子对HIV疾病进展的影响也存在差异。我国HLA与HIV关系的研究主要集中在HLA与HIV易感性分析，HLA与HIV疾病进展的关系的研究较少。因此，探索我国遗传背景下HLA与HIV疾病进展的关系，并进步一寻找该遗传背景下可能存在的与缓慢疾病进展相关的免疫应答，为HIV疫苗的研究提供理论依据。　　越来越多的证据表明，Gag蛋白特异性免疫应答控制HIV病毒的作用最突出，一些特定的HLA型，如HLA-B*57、B*27以及B*13等限制性Gag蛋白特异性CTL应答与缓慢疾病进展有关。目前已经发现了几个与较好临床结局相关的T细胞表位，如B*57限制的Gag TW10表位和B*27限制性Gag KK10表位，这些表位的发现对于疫苗的研究有重要的意义。因此，本课题将研究对象锁定到我国北方汉族HIV感染者，研究了105例长期不进展者（long term non-progressors，LTNPs）及321例典型进展者(typital progressors，TPs)两组人群HLA等位基因分布的差异，应用logistic回归分析发现HLA-A*30-B*13-C*06与缓慢疾病进展相关，并进一步将研究对象锁定到与B亚型感染的HLA-A*30-B*13-C*06阳性的缓慢疾病进展者，分析其体内可能存在的与延缓疾病进展相关的Gag蛋白特异性CTL应答，筛选出的优势表位可作为疫苗研制的候选资源。　　方法：　　一、研究对象　　我国北方汉族HIV-1感染者宿主HLA与艾滋病疾病进展关系研究对象:以我国北方地区的河南、辽宁以及吉林省为主要现场，其中河南以及吉林省感染者主要是从中国疾病预防控制中心的国家流行病学数据库中随机抽取的，而辽宁省感染者主要来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊，上述患者均为汉族，所有标本全部由中国医科大学附属一院艾滋病确认实验室经WB试验确认阳性。LTNP判定标准为:感染HIV病毒10年以上，未经抗逆转录病毒治疗，连续两次CD4+T细胞测定均在500个/μl以上;TP判定标准为:感染时间5-10年，未经抗病毒治疗的情况下CD4+T细胞范围在500个/μl以下。本研究从50000例HIV感染者中筛选出符合LTNP标准的HIV感染者105例，随机选取符合TP纳入标准的HIV感染者321例，患者标本采集时间为2004年-2008年，每例患者至少随访两次，CD4+T细胞计数及病毒载量每6个月检测一次。　　HLA-A*30-B*13-C*06阳性的HIV感染的缓慢疾病进展患者Gag蛋白特异性CTL应答特征研究对象:9例来自河南经既往采供血途径B亚型感染的缓慢疾病进展患者(slow progressors，SP)，均携带HLA-A*30-B*13-C*06单倍型。上述患者纳入队列时感染时间超过15年以上，CD4+T细胞测定值大于500个/μl。510099患者接受过两次母婴阻断治疗（服用奈韦拉平），治疗时间分别为2006年和2011年的8-12月，除此之外，其余患者均未进行抗病毒治疗。全血样本采集时间从2009-2012年，每例患者至少随访3次，应用Ficoll-PaqueTM Plus密度梯度离心分离PBMC细胞，患者510099采集PBMC的时间距离首次母婴阻断治疗时间为46个月。　　纳入本课题研究的所有患者均签署了知情同意书，并通过了中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。　　二、实验方法　　（一） HLA与HIV疾病进展相关性研究　　1、CD4+T细胞计数　　将20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入CD4绝对计数管中，加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACSMULTISET软件检测并进行自动分析，计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。　　2、病毒载量检测　　应用Roche公司的COMBAS AmpliPrep/COMBAS Taqman仪器进行HIV病毒载量的检测，检测范围为25-1000，000 copies/ml。　　3、DNA提取　　外周血白细胞DNA的提取，使用lmlEDTA抗凝外周静脉血，采用QIAampDNAMini试剂盒，按照试剂盒说明书标准方法快速提取全基因组DNA200μl。将纯化后的DNA置-20℃保存备用。　　4、HLA等位基因分型检测　　应用One Lamda公司的Micro SSPTM试剂盒进行HLA分型（PCR-SSP方法）。根据产物有无及片段的大小，对照Micro SSPTM HLA-Ⅰ类基因DNA分型判读卡并结合One Lamda DNA/LMT软件确定基因型。　　5、HLA单倍型分析　　应用在线工具http://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/hla.html进行HLA连锁不平衡分析，即通过Fishers确切检验对连锁不平衡进行筛选，之后应用Bonferroni进行多重假设检验验证。应用Pypop软件中的Expectation-Maximization(EM)程序进行单倍型频率分析。　　（二） Gag基因TA克隆测序　　1、HIV-1基因组RNA提取　　病毒基因组RNA使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAgen，German)按操作说明从血浆标本提取基因组RNA，-80℃保存备用。　　2、Nested-PCR gag基因扩增及TA克隆测序　　采用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)扩增gag全长。第一轮外侧引物172A(5-ATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3628-648 nt of HIV-1HXB2)和 Gag-6(5-TAATGCTTTTATTTTYTCTTCTGTCAATGGC-32651-2621 nt of HIV-1 HXB2)，第二轮内侧 Gag-763(5-TGACTAGCGGAGGCTAGAAGG-3763-783 nt of HIV-1 HXB2)和Gag-5(5-TTCCYCCTATCATTTTTGGTTTCC-32377-2400 nt of HIV-1 HXB2)。扩增条件:第一轮:50℃，30min;94℃变性5 min;94℃30s，50℃30s，72℃2min3个循环;94℃30s，55℃30s，72℃2min32个循环;72℃延伸10min.;4℃保温。第二轮:94℃变性5min;94℃30s，55℃30s，72℃2min30个循环72℃延伸10min.;4℃保温。1％琼脂糖凝胶电泳后，对比Marker切下1600bp阳性片段，QIAgen胶纯化试剂盒按照操作说明纯化回收目的基因片段。纯化产物以40ul去离子水洗脱。将其连接入TOPO载体克隆后获得每一个患者的gag序列，并进行测序分析。　　（三） CTL应答反应　　1、肽段合成　　RL42毒株为我国最早分离得到了B亚型的毒株，并且与我国中部地区流行的B亚型毒株有非常密切的进化关系，该序列能够较好的代表本研究人群的流行的毒株。本研究以RL42为参照，合成覆盖Gag蛋白的18-20meroverlapping肽，共合成54个长肽（西安美联公司）。此外，结合患者的自体病毒序列，合成了8个9-mer的短肽及13个20-mer变异肽(Sigma-Aldrich(US))。　　2、ELISPOT法测定T细胞应答　　为尽量减少PBMC的用量，本实验采用矩阵肽段筛选法，即首先利用肽段矩阵对所有肽段进行CTL反应初筛。矩阵由肽池组成，每条肽段均会出现在两个不同的肽池中，然后对反应阳性的肽池对照矩阵表确定阳性肽段。本研究中共混成15个肽池(7×8)，采用美国BD公司ELISPOT试剂盒测定。即用相应的抗体包被PVDF膜96孔板，每孔加入100μl浓度为1×106/ml的患者PBMC，同时加入Gag蛋白不同的多肽;阳性对照孔加入PHA作为质控，阴性对照孔加入完全培养基，37℃，5％CO2孵育18-24小时。加入生物素标记的检测抗体，室温孵育2小时后加入辣根过氧化酶标记的链菌亲和素，1小时后加入显色剂，30min后终止反应。经美国CTL公司ELISPOT分析仪读取孔中斑点个数，减去阴性对照孔的数值后根据孔中细胞浓度计算每106个PBMC中点形成细胞个数，结果为点形成单位（spot forming unit，SFU）。SFU高于阴性对照平均值2个标准差以上且＞50 SFU/106PBMC为阳性。　　3、免疫逃逸突变验证　　结合HLA相关的氨基酸多态性位点分析的结果，分别合成与RL42序列一致的野生肽段及不同氨基酸变异的肽段，对不同肽段的反应浓度进行倍比稀释，稀释浓度范围100ng/ml-0.0001ng/ml，采用美国BD公司ELISPOT试剂盒测定其CTL应答的强度，判断其交叉反应活性。　　结果：　　一、我国北方汉族HIV-1感染者宿主HLA等位基因及单倍型与艾滋病疾病进展相关性研究　　1、本研究在426例北方汉族HIV-1感染者中共检测到了14种HLA-A、28种HLA-B以及14种HLA-C等位基因座位上特异性抗原型，常见的HLA-A基因为:A*02、A*11、A*24、A*30和A*33，HLA-B基因:B*40、B*13、B*15、B*51、B*07和B*35，HLA-C基因为:C*03、C*07、C*08、C*06、C*12以及C*01。　　2、本研究在426例北方汉族HIV-1感染者中共检测到了25种2-等位基因单倍型以及7种3-等位基因单倍型，A*30-B*13、B*13-C*06、A*30-C*06以及B*40-C*08表现为较强的连锁不平衡。常见的HLA-A-B-C单倍型为HLA-A*30-B*13-C*06、A*02-B*46-C*01和A*33-B*44-C*14等。　　3、应用logistic回归分析，排除性别、年龄、亚型、途径、省份等非遗传因素的影响后，发现HLA-A*30-B*13-C*06和HLA-B*67与缓慢疾病进展相关。　　二、 HLA-A*30-B*13-C*06阳性B亚型HIV-1感染的缓慢疾病进展者Gag蛋白特异性CTL应答特征研究　　1、本研究发现OLP-15、OLP-16、OLP-2和OLP-48为HLA-A*30-B*13-C*06阳性B亚型HIV-1感染的缓慢疾病进展患者的免疫显性表位。　　2、OLP-15/16长肽中可能包含B*13限制性新的B亚型特有的HL9表位，针对OLP-15/16长肽有强的CTL应答个体存在HL9表位特异性强的应答，HL9表位是HLA-A*30-B*13-C*06阳性的B亚型感染的缓慢疾病进展者免疫显性表位。　　3、在HL9表位限制性CTL应答选择压力下，HL9表位内出现了多种氨基酸变异:P146A/S、I147L、S148A/P和P149A/V等，可能与免疫逃逸有关。　　4、本研究人群在OLP-2肽中检测到了G24M、K28R、K28Q、(K26N，K28R)(R20Q，K28R)等变异，同时在510109患者纵向随访过程中出现了K28Q变异。在OLP-48肽中观察到了K436R、I437L、I437V、和(K436R，I437V)变异，上述氨基酸变异对CTL应答的影响有待于进一步验证。　　三、 HLA-A*30-B*13-C*06阳性B亚型HIV-1感染者Gag蛋白CTL应答与艾滋病疾病进展关系的研究　　1、在510096和510097患者体内存在的针对HL9自体病毒肽强的CTL应答以及广泛的交叉反应活性可能与两例患者较高的CD4+T细胞计数及较低的病毒载量有关，而510099患者针对HL9自体病毒肽无应答，交叉反应活性差。　　2、510082、510084及510110患者患者体内存在OLP-2自体病毒肽强的CTL应答;510082和510084针对(K26N，K28R)变异肽表现出不同的应答。510109患者在随访过程中HIV病毒出现了K28Q变异并成为优势株，该变异可能与免疫逃逸有关，伴随着CD4+T细胞的显著下降及VL上升。　　3、510121和510013患者疾病进展缓慢，体内存在OLP-48自体病毒肽强的CTL应答，并具有较好的交叉反应活性。　　4、HLA-A*30-B*13-C*06阳性的B亚型HIV-1感染的缓慢疾病进展者中存在HL9、OLP-2及OLP-48三个免疫显性表位中至少一个自体病毒肽强的CTL应答，可能在控制HIV病毒中发挥了一定的作用。　　结论：　　1、我国北方汉族HIV-1感染者中，HLA-A*30-B*13-C*06和HLA-B*67与艾滋病缓慢疾病进展相关。　　2、HL9、OLP-2以及OLP-48为HLA-A*30-B*13-C*06阳性B亚型HIV-1感染的缓慢疾病进展者的免疫显性表位，HL9表位为B*13限制性新的B亚型特有的表位。　　3、HLA-A*30-B*13-C*06阳性B亚型HIV-1感染的缓慢疾病进展者中存在HL9、OLP-2及OLP-48三个免疫显性表位中至少一个自体病毒肽强的CTL应答，可能在控制HIV病毒中发挥了一定的作用。