背景：胃癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一,具备高隐匿性、高发病率、高病死率的临床特征。胃癌前病变(GPL)是病理组织学概念,指胃黏膜上皮出现肠上皮化生(GIM)及异型增生(GED)的病变,并且常继发于慢性萎缩性胃炎(CAG)。根据Correa假说,肠型胃癌的发生是一个渐进演变的过程,胃癌前病变是慢性萎缩性胃炎和侵袭性胃癌之间的“桥梁”,是胃黏膜上皮恶性转变的关键阶段。目前CAG-GPL仍然缺乏西医特效药物,以维酶素为代表的CAG治疗药物,临床报道在一定程度上能延缓CAG进展、预防CAG-GPL细胞增生引起的恶变,但因服用时间较长、效果欠佳等缺点,从而限制了其在临床上的应用。祖国医学运用辨证论治、专方专治等方法不仅能有效改善CAG-GPL患者的临床症状,阻断或逆转CAG-GPL病理组织学进展,且毒副作用小、靶点多、安全性良好。健脾化瘀解毒方(解毒方)是我们临床治疗萎缩性胃炎胃癌前病变的效方,具有补益脾胃、化瘀通络、败毒抗瘤的功效。前期临床研究发现解毒方治疗“稳定型”胃癌前病变具有较好临床疗效。近年来,从干细胞途径研究恶性肿瘤是一大热点,富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(Lgr5)可能是近年来发现的胃干细胞／肿瘤干细胞标志物。正常情况下,Lgr5+细胞是局限于胃窦腺体基底部的成体干细胞,是胃黏膜上皮更新的源泉,维持正常数量的胃黏膜上皮细胞及腺体。但在长期持续的幽门螺杆菌(Hp)感染、炎症刺激、免疫抑制、或理化因素的作用下,干细胞会异常分化、过度增殖,导致恶性肿瘤的产生。另外,Lgr5是Wnt信号通路的重要靶基因,Wnt信号通路的异常激活可引起Lgr5表达水平的上调或下调,调控肿瘤干细胞增殖、分化、转移,进而在恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥关键作用。目前,从Wnt/Lgr5信号通路探讨胃癌前病变阶段胃黏膜恶性转变机理和中药干预疗效机制的研究较少报道。目的：①建立胃癌前病变大鼠实验模型,观察解毒方对胃癌前病变大鼠一般情况、宏观表征的影响,同时探讨解毒方对胃癌前病变大鼠胃黏膜肠上皮化生、异型增生病变的干预效应,以及胃黏膜上皮细胞超微结构的干预作用。②观察Lgr5+细胞在胃腺体的空间定位、Lgr5+细胞数目变化,探讨Lgr5+细胞的生物学功能及在胃癌前病变中扮演的角色。同时探讨解毒方对Lgr5+细胞“离巢”事件的影响。③检测Wnt/Lgr5信号通路的关键因子如Wntl、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、C-myc等在胃黏膜上皮组织中的表达水平,观察解毒方对以上Wnt/Lgr5信号通路关键因子的干预效应。方法：SPF级雄性SD大鼠77只,6-8周鼠龄,体质量120-140g,随机分为空白组(10只)、模型组(15只)、维酶素组(13只,0.2 g·kg-1·d-1)、解毒方15 g·kg-1·d1剂量组(13只,解毒方A组)、解毒方7.5 g·kg-1·d-1剂量组(13只,解毒方B组)、解毒方3.75 g·kg-1·d-1剂量组(13只,解毒方C组),共6组。空白组大鼠常规饲养,不予任何造模因素。模型组、维酶素组、解毒方各组大鼠给予200ug · mL-1 N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮用,配合饥饱失常法、小承气汤灌胃的综合造模方法复制胃癌前病变大鼠模型,持续19周。第9周从模型组随机选择2只大鼠,处死后取胃黏膜组织,确认出现胃黏膜肠上皮化生病变后,治疗组连续灌胃给药共10周。第19周,处死全部大鼠后取小弯侧胃体-窦交界处胃黏膜,制备胃黏膜上皮组织。采用AB-PAS染色法光镜下观察各组大鼠胃黏膜上皮肠上皮化生病变情况(肠上皮化生病灶范围及程度)；HE染色法光镜下观察各组大鼠胃黏膜上皮异型增生病变情况(主要包括胃黏膜上皮细胞异型性改变、腺体结构紊乱、异常分化状态)；透射电镜下观察各组大鼠胃黏膜上皮细胞超微结构变化(主细胞、壁细胞的细胞核形态、大小、染色质分布、核间隙、核浆比、胞浆空泡样变、线粒体结构、微管泡结构)。荧光定量RT-qPCR法检测各组大鼠胃黏膜上皮细胞C-myc mRNA表达。免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜上皮Lgr5表达,光镜下观察Lgr5+细胞在胃腺体的空间分布、Lgr5+细胞数目变化。免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜上皮Wntl蛋白、Wnt3a蛋白、β-catenin蛋白、MMP-7蛋白的表达。结果：①胃黏膜HE染色显示,模型组大鼠胃黏膜上皮出现了异型增生病变(腺体结构不完整、排列拥挤、边界不清楚,甚至分支和折叠现象,细胞核深染,呈雪茄样改变,可见细胞核假复层改变,细胞核极性减弱,核分裂征象常见)。AB-PAS染色发现模型组大鼠出现弥漫性肠上皮化生病变(胃黏膜上皮发现范围较大的蓝染灶)。以上均表明胃癌前病变大鼠模型复制成功。数据显示,与模型组相比,解毒方各组大鼠弥漫性肠上皮化生发病率显著降低(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比,解毒方C组中-重度异型增生发病率显著降低(P<0.05),解毒方A组、解毒方B组的中-重度异型增生发病率虽有不同程度降低,但无显著统计学意义(P>0.05)。②透射电镜结果显示,模型组大鼠胃黏膜上皮主细胞、壁细胞出现细胞核异形改变、核浆比增大、染色质异常,此外可见细胞核固缩、核碎裂形成、核间隙增宽、胞浆内大量空泡样变。另外,主细胞可见内质网数量明显减少、少量残存,壁细胞线粒体结构破坏、数量减少,微管泡结构破坏、或见部分管腔扩张。解毒方各组主细胞、壁细胞的病变程度较模型组相比具有-定程度改善,主要表现为细胞核浆比趋于正常、胞浆空泡样变减少、内质网结构数量部分恢复。③正常胃黏膜上皮见Lgr5阴性表达或仅在胃黏膜隐窝底部见到少量散在的Lgr5+细胞。而模型组胃癌前病变大鼠胃黏膜上皮Lgr5+细胞数目显著增多,密集分布于胃黏膜上皮全层,Lgr5+细胞可能从胃黏膜隐窝底部“离巢”至上皮层。治疗组中可见Lgr5+细胞主要散在分布于胃黏膜上皮全层,Lgr5+细胞数目不同程度减少,以上变化以解毒方C组最为显著。数据显示,模型组胃癌前病变大鼠Lgr5蛋白表达较空白组显著增加(P<0.01),解毒方能显著抑制胃癌前病变大鼠Lgr5蛋白过度表达(P<0.05)。④模型组GPL大鼠胃黏膜上皮细胞的C-myc mRNA表达水平较空白组显著增加(P<0.01)。与模型组相比,解毒方各组大鼠C-myc mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)。与维酶素组相比,解毒方C组大鼠C-myc mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。与解毒方A、B组相比,解毒方C组大鼠C-myc mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。⑤模型组GPL大鼠胃黏膜上皮Wntl蛋白表达水平较空白组显著增加(P<0.05)。与模型组相比,解毒方各组大鼠Wntl蛋白表达水平均显著降低(P<0.01或P<0.05)；与维酶素组相比,解毒方C组大鼠Wntl蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；而解毒方A、B组大鼠Wntl蛋白表达水平则无显著性差异(P<0.05)。⑥模型组GPL大鼠胃黏膜上皮Wnt3a蛋白表达水平较空白组显著增加(P<0.01)。与模型组相比,维酶素组、解毒方各组大鼠Wnt3a蛋白表达虽有下降趋势,但无显著统计学意义(P>0.05)。⑦模型组GPL大鼠胃黏膜上皮β-catenin蛋白表达水平较空白组显著增加(P<0.01)。与模型组相比,维酶素组、解毒方各组大鼠β-catenin蛋白表达水平均显著降低(P<0.01或P<0.05)。与维酶素组相比,解毒方各组大鼠β-catenin蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。⑧模型组GPL大鼠胃黏膜上皮MMP-7蛋白表达水平较空白组显著增加(P<0.01)。与模型组相比,解毒方C组大鼠MMP-7蛋白表达水平显著降低(P<0.01),而维酶素组及解毒方A、B组大鼠MMP-7蛋白表达水平虽有下降,但无显著统计学意义(P>0.05)。与维酶素组相比,解毒方C组大鼠MMP-7蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而解毒方A、B组大鼠MMP-7蛋白表达水平则无显著性差异(P>0.05)。结论：①本次研究采用MNNG溶液自由饮用、饥饱失常法、小承气泻下耗气的综合造模方法,成功复制了胃癌前病变大鼠模型。②解毒方能在一定程度上缓解GPL大鼠胃黏膜肠上皮化生、异型增生病变,改善GPL大鼠胃黏膜上皮主细胞、壁细胞的异常超微结构病变。③胃癌前病变阶段胃黏膜病变时Lgr5+细胞可能不局限于隐窝底部,脱离正常微环境进而促进细胞异常分化、过度增殖,其“离巢”可能参与胃黏膜恶性转变过程。健脾化瘀解毒方可在一定程度上抑制Lgr5+细胞过度增殖。④胃癌前病变阶段存在Wnt/β-catenin信号通路的失调,可能与Lgr5+细胞的早期离巢现象相关。解毒方可能通过抑制Wnt/Lgr5信号通路及相关靶因子异常激活状态,从而阻断甚至逆转胃癌前病变。