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本文研究了酶和水解条件对乳清蛋白水解度和水解物DPPH自由基清除率的影响。采用胰蛋白酶,复合蛋白酶,风味蛋白酶,中性蛋白酶以及商业粗酶,碱性蛋白酶2709和中性蛋白酶AS1398,在它们的最适水解pH和温度下水解乳清蛋白4h。所有酶水解得到的乳清蛋白水解物都具有抗氧化活性。风味蛋白酶和AS1398中性酶得到的水解物的DPPH自由基清除率最高,2709碱性蛋白酶具有最高的水解度。和其他酶乳清蛋白水解物相比,胰蛋白酶水解物具有稳定的溶解性,所以被用于研究其他的水解条件的影响作用。研究表明:温度,pH值,底物浓度和酶浓度影响乳清蛋白胰蛋白酶水解物的水解度和DPPH自由基清除能力。
采用胰蛋白酶水解底物浓度40 mg/mL的乳清蛋白1h,采用响应面回归分析得到最佳水解工艺为:温度40.12℃、酶底物比6％(w/w)、pn7.02。采用二次和线性模型方程分析水解度和DPPH自由基清除率,结果表明:温度和pH值对水解度和DPPH自由基清除率具有显著影响,pH值的影响尤为显著。在最佳酶解条件下得到的乳清蛋白胰蛋白酶水解物的水解度为22.90±0.12％。DPPH自由基,超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率的IC50分别为4.1,3.7,＜2.5 mg/mL,水解物的浓度为10.00 mg/mL时,还原力为0.886±0.010。乳清蛋白胰蛋白酶水解物主要由分子量小于1000 Da的短肽和氨基酸组成。与肽的抗氧化性质相关的疏水性氨基酸含量为水解物氨基酸总含量的39.01％。
采用10 kDa的超滤切向流的酶膜反应器,流速的范围为10-60 mL/min,初始水通量和截留再循环流速的范围为55-160mL/min,采用渗透总量,产物的抗氧化活性,平均膜通量和最终压力来评价酶膜反应器的稳定性。在低水通量10mLs/min时,较高的再循环流速会有高的平均膜通量,值为52％,而较低的再循环流速下,膜平均通量为29％.,当初始水通量升高至60 mL/min时,降低再循环流速,平均膜通量从13.07％降到11.33％。渗透总量随着再循环速率的提高而增加,再循环流速为160 mLs/min时,渗透总量为579 mLs,但是此时的DPPH自由基清除率为64.02±0.19％,低于130mLs/min时的65.40±0.38％。在高再循环流速下,截留组分的DPPH自由基清除率高于透过组分。不考虑初始水通量,在低再循环流速下,渗透组分的DPPH自由基清除率达到71.37±0.98％,高于高再循环流速下得到的渗透组分的DPPH自由基清除率59.64±0.71。比较最终压力,结果表明,初始水通量不变时,高再循环速率导致高的操作压力＞1.5 bars。
采用box-behnken因子设计优化酶膜反应的条件,该设计中包含影响酶膜反应的因素的三个水平。分别是水解初始的温度(40,45,和50℃),酶浓度(1,2,和3％)和初始水流通(15,20,和25 mLs/min)。指标包括总含量(g),蛋白转化率,透过组分的抗氧化活性,以及最终的操作压力(bar)和平均膜通量。控制底物浓度为40 mg/mL,pH7.0,水解时间为2h。采用10 kDa(聚醚砜)的膜。涉及到六个变量的优化模型的分析研究表明:当最终压力为0.75 bars时,DPPH自由基清除率和总量达到最大,此时,Ti50℃,ES2％,Ji15。DPPH自由基清除率,冻干后水解物的总量和最终的压力值分别为62.56±0.40％,14.78±1.07 g和0.91±0.01 bars。其他的结果为:渗透部分的蛋白含量为83.93±0.27％,透过部分的浓度为22.30±1.20mg/mL。平均膜通量为36.79±0.88％,水解度为18.06±0.15％。
采用二级超滤浓缩分离从酶膜反应(10 kOa)得到的酶解物。采用3 kDa和1 kDa的切向流膜分离酶解物以期减小颗粒粒径。收集冻干10-3 kDa组分(3 kDa截留组分),3-1 kDa组分(1 kDa截留组分),和＞1 kDa(1 kDa透过组分)。酶解物的相对分子量分布范围在130 Da～10000 Da。所有的组分都具有抗氧化活性并且有浓度依赖性。酶膜反应中得到的水解物的IC50值分别为:DPPH·,7.85;O2-·,3.25;·OH＜2.50mg/mL,10-3 kDa组分的IC50值分别为:DPPH·,6.49;O2-·,3.60;·OH＜3.64mg/mL。酶膜反应得到的水解物和10-3 kDa组分富含必需氨基酸和高组分的疏水性氨基酸。二级超滤分离降低了浓缩物的必需氨基酸和疏水性氨基酸的含量。酶膜反应器和二级超滤分离联用是制备具有抗氧化活性的乳清蛋白肽的有效方法。分别研究分批反应,酶膜反应以及酶膜反应与超滤浓缩联用得到的水解物的对热,pH和贮藏稳定性。结果表明它们以冻干的状态在环境温度下都具有好的贮藏稳定性,并且在酸性条件(pH6.3)下具有高的抗氧化活性,耐高温(63℃下30 min)。它们在中性条件下具有好的溶解性。