接触抑制现象具有重要的生理意义,其与机体内器官、组织的形态、大小以及各类细胞数量的控制有着密切的关系。机体的组织器官生长到一定程度后会自然停止生长,而不是无限制的长大;在体外培养过程中,当细胞分裂增殖到一定程度,达到相互接触时,细胞停止分裂。一般认为,接触抑制是由于细胞数量的增加消耗了局部区域的促分裂因子;另一方面是细胞接触时自身分泌了一些细胞增殖的抑制因子。但Nakatsuji Y和HM.Robert的研究表明:星形胶质细胞的接触抑制不是由可溶性因子所引起,而是由星形胶质细胞间的相互接触诱发了增殖抑制机制所引起的。目前接触抑制的机制不甚清楚。为了研究接触抑制的原理,我们以星形胶质细胞做为模型细胞,研究了接触抑制的可能机制,并探讨了CD81在其中的可能作用。本研究共分三部分。第一部分为了观察引起星形胶质细胞接触抑制的作用究竟是由于细胞自身分泌了一些细胞增殖的抑制因子,还是由于细胞相互接触而引起的,本研究将纯化的星形胶质细胞分三组,在细胞处于低汇合,半汇合,完全汇合时加入接触抑制条件培养基,继续培养20h后,以MTT法检测细胞数、以流式细胞仪检测细胞周期时相细胞指数并进行统计学分析。条件培养基没有抑制星形胶质细胞的增殖,对其细胞周期也无明显影响。结果显示星形胶质细胞的接触抑制不是由于星形胶质细胞接触时释放的可溶性因子引起的,而是由星形胶质细胞间的相互接触诱发了增殖抑制机制所引起的。并进一步观察将处于接触抑制的星形胶质细胞分离去接触化,观察细胞是否再次进入增殖状态,以及汇合后是否又进入抑制状态。我们将处于接触抑制的星形胶质细胞分离,再培养,当细胞将至低汇合、半汇合和全汇合时加入BrdU,继续培养6h后收集细胞,与结合有FITC的抗BrdU抗体共孵育,然后通过流式细胞仪检测细胞周期和细胞的BrdU阳性率。结果显示:处于接触抑制的星形胶质细胞分离、再培养,细胞处于低汇合和半汇合状态时,细胞增殖率再次增高。当细胞全汇合处于接触状态时,细胞增殖率明显下降。表明:处于接触抑制的星形胶质细胞分离去接触后,细胞又恢复了增殖能力。而再次相互接触时,细胞增殖又受到抑制。CD81分子,即抗增生抗体识别的靶抗原(Target of the Antiproliferative Antibody-1, TAPA-1),它是一种分子量为26KD的非糖基化膜蛋白,属干四跨膜区蛋白( tetraspanin )超家族成员,含有4个跨膜转膜区和2个胞外区,广泛分布在各种组织和细胞的表面,可影响细胞的粘附、激活、增殖和分化,有改变细胞形态、抑制合胞体形成等生物学功能。Sullivan等人研究发现未成熟的星形胶质细胞不表达或低表达CD81,随着星形胶质细胞的逐渐成熟,CD81的表达也逐渐增强,逐步达到成年水平。CD81对细胞的增殖具有调节的作用,并且在不同的细胞发挥的作用不同。因此第二部分研究了抗CD81抗体对处于不同状态的纯化培养的星形胶质细胞增殖抑制的影响。将纯化的星形胶质细胞分三组,在细胞处于低汇合,半汇合,完全汇合时加入抗CD81抗体(4μg/ml),继续培养18小时后收集细胞,以MTT比色法和流式细胞术观察抗CD81抗体对处于不同状态星形胶质细胞的影响并进行统计学分析。结果表明与对照组相比,抗CD81抗体对处于低汇合,半汇合的星形胶质细胞有明显抑制作用,其抑制率分别为15.56%和34.44%,对处于完全汇合状态的星形胶质细胞有轻微抑制作用,其抑制率为9.62%。因此抗CD81抗体对处于低汇合和半汇合的星形胶质细胞均有显著抑制作用,对已经处于接触抑制的星形胶质细胞只有轻微抑制作用。为了进一步研究抗CD81抗体对星形胶质细胞抑制作用的时效关系,第三部分研究了抗CD81抗体作用不同时间后对星形胶质细胞增殖抑制的作用。将纯化的星形胶质细胞培养12小时后,加入抗CD81抗体(4μg/ml),分别作用18小时,32小时及96小时后,以MTT比色法检测星形胶质细胞的细胞活性,计算抑制率;以流式细胞仪检测细胞周期时相。MTT法检测结果表明与对照组相比,抗CD81抗体作用18小时,32小时及96小时后均对星形胶质细胞有显著抑制作用,其抑制率分别为11.17%,13.17%,27.49%。流式检测结果表明抗CD81抗体作用18小时后,S期细胞指数与对照组相比,增加了16.09,星形胶质细胞主要被阻滞于S期;作用32小时后, G0/G1期细胞指数与对照组相比增加了3.08; 96小时后,细胞指数与对照组相比增加了5.87,细胞主要滞留于G0/G1期,即抗CD81抗体作用不同时间后均对星形胶质细胞有显著抑制作用,抑制作用随时间增加而增强。早期抗CD81抗体使星形胶质细胞阻滞于S期,随着作用时间的延长,逐渐使细胞阻滞于G0/G1期。结论:星形胶质细胞的接触抑制不是由可溶性因子所引起,而是由星形胶质细胞间的相互接触诱发了增殖抑制机制所引起的。处于接触抑制的星形胶质细胞分离去接触后,细胞又恢复了增殖能力。而再次相互接触时,细胞增殖又受到抑制。抗CD81抗体对处于低汇合和半汇合的星形胶质细胞均有显著抑制作用,对已经处于接触抑制的星形胶质细胞只有轻微抑制作用。抗CD81抗体作用不同时间后均对星形胶质细胞有显著抑制作用,抑制作用随时间增加而增强。早期抗CD81抗体使星形胶质细胞阻滞于S期,随着作用时间的延长,逐渐使细胞阻滞于G0/G1期。CD81在星形胶质细胞接触抑制中起到了一定作用,其机制可能是抗CD81抗体与膜上的CD81结合,启动了星形胶质细胞增殖抑制机制。