西他列汀作为一种治疗Ⅱ型糖尿病的手性胺药物,疗效好、副作用小,具有良好的市场前景。西他列汀的合成主要有化学法和生物法,与西他列汀化学合成法相比,生物催化制备西他列汀具有绿色环保、产品光学纯度高等优点。本文对生物催化制备西他列汀所使用的ω-转氨酶进行了初步改造,并优化了制备工艺。本文首先于Gene Bank获得公开的ω-转氨酶ATA-117基因序列,构建E.coli BL21/pET28a-ATA-117工程菌,验证其转氨活性。使用邻苯二甲胺二盐酸作为显色氨基供体,验证了通过平板培养基上菌落显色反应指示转氨反应的可行性,并以此构建了平板显色的高通量筛选方法。对模板ω-转氨酶ATA-117的124、126、150、152位氨基酸进行定点饱和突变,获得了 T126L(41.0%),T126N(31.1%),S150Y(23.6%),T126F(20.5%),S152I(10.7%)五个有利突变,并以T126L为基础,对其余突变的叠加效果进行了研究。探索了突变株T126L的最佳发酵条件,最佳诱导剂浓度为IPTG1.OmM,最佳诱导温度为35℃,最佳诱导时机为OD600 0.64左右(发酵时间5h左右),最佳诱导时长为12h。在最佳发酵条件下,收集细胞后冻干,最终酶活可达6321U/g。随后在30L发酵罐中高密度发酵突变株T126L,发酵结束OD600达到115.432。以突变株T126L替代ATA-117,优化生物催化制备西他列汀工艺,优化后的反应条件为:助溶剂DMSO浓度50%,pH9.0,反应温度50℃,底物浓度200g/L。在此条件下,全细胞催化16小时后转化率达到98%以上。然后,进一步对产物西他列汀进行了分离纯化,最终收率66.9%,ee>99.99%。