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脓毒症（Sepsis）是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中,是机体对感染的一种全身性炎症反应（SIR）,表现为不能控制的炎症反应,脓毒症和SIRS在性质和临床表现上基本是一致的,只是病因不同而已。炎症反应是感染或非感染因素如细菌感染、外伤、烧伤、较大外科手术等,刺激宿主免疫系统,释放细胞炎症介质,发生的一种临床病理过程。以细胞因子为代表的多种炎症介质的失控性释放,产生过度炎症反应,不仅不能去除机体的致病因素,反而会抑制免疫系统。其继续发展则可以导致全身炎症反应综合征（SIRS）、脓毒症和多器官功能不全。其共同病理生理特征是自身的免疫失控、体内白细胞大量激活,产生过量的炎症介质而引起全身多个脏器损伤。一氧化碳（carbon monoxide,CO）在机体内由血红素加氧酶（HO）催化血红素产生,CO过去曾被认为是破坏细胞呼吸作用的有害物质。最近的研究发现CO是一种气体信号分子的,在损伤诱导的各种机体应激中具有保护组织的作用,并且CO在心血管、神经和免疫的生理和病理过程中都起着重要的调节作用。我们研究发现CO对炎症反应也具有抑制作用,但其机制尚未明确。在本研究中,我们利用可以在机体内释放CO的一种新型金属—羰基化合物,一氧化碳释放分子（tricarbonyldichlororuthenium（Ⅱ）dimer,CORM-2）,通过体外预处理和在体实验研究是否外源性CO对炎症反应具有抑制作用及其有效浓度范围,并且探讨CO的作用机制。目的血管内皮细胞（VEC）是机体中一类重要的细胞群体,在体内广泛分布形成血液和组织之间的界面,构成机体的天然免疫屏障,具有重要的分泌、合成、代谢和免疫功能。由于新生儿脐带方便、易取,而且是同种细胞,排异性小,通过扩增可获得大量的内皮细胞,因此,我们采用HUVEC进行炎症机制的研究。在各实验室中,HUVEC培养条件也各异。本实验即为了创建本实验室HUVEC标准化模型并对此模型进行验证而进行了详细的研究。方法人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）来源于6小时内新生胎儿脐带,宜在37℃,含5%CO2、95%湿度的环境中培养,采用M199培养基。培养基中应含20%热灭活的小牛血清,10IU/ml肝素,抗生素（100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素）,1.5μg/ml两性霉素B和80μg/ml内皮促有丝分裂剂,在75cm2培养瓶中培养,24h后更换培养液,以后每隔2d换液1次,6-8天后细胞生长达融合。用1ml 0.25%胰蛋白酶和0.025%EDTA混合液（V=1/1）在37℃条件下消化,按1:3的比例传代。观察HUVEC的形态,并且需要对细胞形态、细胞内Ⅷ因子相关抗原表达进行检验。倒置显微镜下观察细胞形态并摄片,运用免疫组化法检测细胞内Ⅷ因子相关抗原的表达。结果本实验室成功建立了HUVEC模型,实验细胞生长良好;经验证,该模型细胞生长融合后呈典型的铺路石状排列,细胞内Ⅷ因子相关抗原阳性率达95%,绿色的颗粒均匀地分布在整个细胞浆内。结论本实验室培养的HUVEC在细胞形态、生长情况和特异性分泌抗原上符合实验要求。实验条件稳定易控,因而在本实验室条件下生长的HUVEC模型可以用于体外实验。目的为了探讨机体脓毒症时的炎症反应机制,我们采用LPS对HUVEC进行刺激建立细胞脓毒症模型,在离体方面研究炎症反应的机制。CO是一种可扩散性气体信息分子,具有细胞保护作用,抗氧化的功能及抗炎作用。但是外源性CO抗炎作用的机制并未有明确的研究,为了评价CORM释放的CO对LPS诱导的内皮细胞活性的作用及潜在的机制,本课题也将进一步进行阐明。方法取传代后生长达到融合的HUVEC,弃去细胞培养基,加入10μg/ml的LPS孵育液200μl,置入培养箱培养4h,空白对照组加入200μL M199液后也置入培养箱培养,培养箱条件均为37℃、5%CO2和95%相对湿度。运用50μM、100μM剂量的CORM-2对HUVEC预处理2h,再进行LPS刺激4h,或者与LPS共同培养4h后,观察炎症反应过程当中,多种细胞因子、黏附分子、转录因子,以及参与炎症反应放大与延续的多种酶的变化。结果HUVEC脓毒症模型的建立过程规范,各种条件易于控制,且模型的检测指标明确;损伤后PMN粘附率明显增高,NO、ROS活性明显增加,iNOS、ICAM-1、HO-1蛋白的表达明显增加,NF-κB活性也显著增高。相比与LPS共同培养,CORM-2的预处理对于炎症反应具有更加明显的抑制作用。结论对脓毒症临床研究发现,阻断炎症介质的作用或应用LPS单克隆抗体效果并不明显。因此,阐明LPS激活内皮细胞的分子调控机制显得十分必要。HUVEC的脓毒症模型可以用于在细胞水平研究炎症的反应机制,各种炎症因子、黏附分子、转录因子等都发生了相应的变化。本课题显示,外源性CO的预处理及干预都能抑制炎症的反应,其中外源性CO预处理的作用较大。这一结果,对于临床危重病人的救治具有十分重要的意义。目的为明确机体在严重创伤情况下炎症反应的机制,我们制作了CLP小鼠的在体模型,并利用此模型研究在严重创伤后肝脏炎症反应,进一步明确严重脓毒症小鼠损伤后炎性反应与HUVEC脓毒症模型时炎性反应的关系,同时重点探讨外源性CO对机体严重脓毒症后炎症反应的抑制作用及分子机制。方法6-8w大小的小鼠正常饲养1W后,2%异氟烷麻醉进行盲肠结扎穿刺法建立小鼠脓毒症模型,经病理检测和生命体征、细胞因子、黏附分子、转录因子及参与炎症反应放大与延续的多种酶等指标确定模型的标准化。小鼠在CLP后立即静脉注射CORM-2（8.0mg/kg）,加入在152μl生理盐水中,以正常小鼠为对照组。测定CLP 24小时后肝功能,肝脏ICAM-1、NF-κB和AP-1活性的表达。结果小鼠脓毒症模型的建立过程规范,操作简单,具有可重复性,且模型的检测指标明确。CLP术后24h小鼠肝脏微血管通透性明显增高,肝细胞明显肿胀,胞浆疏松,肝小叶结构紊乱,窦腔内有中性粒细胞聚集,门脉区有较多中性粒细胞浸润;肝功能损害较重,血清中ALT含量升高;血清细胞因子TNF-α、IL-1β表达明显增加,肝组织ICAM-1的表达明显增加,AP-1、NF-κB蛋白表达明显增加。外源性CO的直接干预可以明显抑制炎性反应,保护细胞。结论本脓毒症模型在机体损伤,肝脏的损伤方面达到了预期的要求。CLP小鼠脓毒症模型可以用于在动物方面研究炎症的反应机制,组织形态及功能、各种炎症因子、黏附分子、转录因子等都发生了相应的变化。本课题显示,外源性CO的干预能明显抑制炎症反应。这一结果,对于临床危重病人的救治具有十分重要的意义。