论文部分内容阅读
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide-1,GLP-1)主要由小肠表皮L细胞分泌,临床可用于Ⅱ型糖尿病的治疗。目前,用于该类药物体外活性检定的方法包括发光珠结合检测cAMP、Promega试剂盒检测剩余ATP的方法,这些方法测定结果受环境影响较大、半衰期短、成本高、稳定性差。因此亟待开发一种针对GLP-1类似药物的操作简便、灵敏度高、稳定的体外活性的检定方法。本研究以研究组前期构建的荧光标记细胞株为材料,利用高内涵检测设备,建立了一套特异性高、快速、灵敏的体外活性检定方法,并重点对该方法的回归性、准确度、精密度(重复性)和专属性进行了分析。所建立的方法在标准品±50%范围内线性回归优异,R2>0.98;准确度高,在50%、80%、100%、120%、150%五个水平的测定值与理论值之间差值小于8%;精密度较高,测定结果的RSD均≤10%,准确度和精密度均显著优于2015年版《中国药典》≤20%的标准;专属性(特异性)好,对与调节胰岛素分泌相关的药物-胰高血糖素、利拉鲁肽、生长激素、艾塞那肽等六种药物检测后,证明该方法仅对GLP-1类似药物有反应,且剂量依赖关系明显。结果还表明,新检测方法结果可稳定保持近100 h,远高于稳定期仅1 h的目前国内常用Promega试剂盒方法;新构建的细胞株可连续使用47代以上,而Promega法仅可使用至33代;以单块96孔板计,每次实验成本仅200元左右,显著低于成本近1,000元的Promega法。利用已建立的检测方法,我们对三个不同厂家12批次的不同GLP-1类药的原液及注射液进行了检测,结果均达到要求,证明了该方法的可靠性。论文还对构建的细胞株的信号下游分子-cAMP的量进行了检测,结果表明,虽然重组受体的C端标记了 GFP但并没有妨碍下游信号信息的传递。最后,论文利用已构建的细胞株,初步建立了从中草药中筛选GLP-1类似天然活性成分的方法,并对三七、黄芪、黄连、栀子等100多种天然产物进行了活性成分筛选。总之,本论文成功建立了新颖的GLP-1类似药物体外生物学活性的检定方法,方法具有专属性强、稳定性高、操作简易、成本低的优势,适合于所有GLP-1类似药物的体外生物学活性检测。并初步建立了GLP-1类似天然活性产物的活性细胞筛选方法,初步结果表明,三七、天麻可能含有激动剂的活性成分,为今后进一步开发Ⅱ型糖尿病的口服小分子药物提供了实践基础。