论文部分内容阅读
猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的成员,是迄今发现的最小的动物病毒。基因型包括PCV1(Porcine circovirus type1, PCV1)和PCV2(Porcine circovirus type2, PCV2)。PCV1是PK15细胞系的一种污染物,对猪没有致病性；而PCV2是引起断奶仔猪多系统衰弱综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)等的主要病原。自1996年以来,PCV2感染引起的疾病在世界各地蔓延,对全世界养猪业造成了巨大的损失。因此,对于PCV2相关疾病的控制是人们关注的重要问题。PCV1与PCV2的基因组是相似的,都包含两个主要的开放阅读框,ORF1和ORF2, ORF1主要编码与病毒复制相关的蛋白,ORF2编码病毒的核衣壳蛋白,PCV1与PCV2的ORF1同源性约为85%,而ORF2的同源性约66%,在PCV1与PCV2之间不产生交叉反应,且ORF2编码的蛋白是病毒的主要结构蛋白,大小约28kD,可以刺激机体产生保护性的抗体,因此ORF2基因是PCV2诊断及疫苗研究的热点。杆状病毒表达系统己成为基因工程四大表达系统之一,该系统具有不感染脊椎动物、外源基因克隆量大、重组病毒筛选率高以及表达蛋白活性好的优点而被广泛应用于微生物学、医学等领域。本研究利用重组杆状病毒表达系统使PCV2-ORF2基因在昆虫细胞中得到表达,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,利用杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,72小时后Sf9细胞出现明显病变,提取转染后细胞的DNA,进行PCR鉴定,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。检测蛋白的表达及测定重组杆状病毒的滴度,将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6-8周龄BALB/c小鼠,免疫后的小鼠效价高者取其脾脏与Sp2/0细胞融合,将融合后的细胞用IFA进行检测筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2、5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定,结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应。病毒的中和试验证实,3株单抗没有中和活性,均不是针对PCV2-Cap蛋白中和表位的单抗,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速有效检测PCV2病原、PCV2TCID50的测定及提高实验室监测能力奠定了基础。