目的外伤性视神经病变能够造成永久性视力损害,但是目前外伤性视神经病变的损伤部位和损伤程度尚不能通过临床常规检查进行明确的诊断和评估。磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)是显示视神经和球后组织解剖细节的公认的首选影像学方法。自其问世以来一直受到大家的关注,在视觉领域成像方面也得到广泛的应用。但是由于视神经结构复杂,受周围结构的影响,对其进行MRI检查有很大的局限性。锰离子具有类钙活性,能够替代Ca2+,来观察及追踪神经元之间的联系,并已有初步进展,而锰离子增强MRI在视神经方面的研究也越来越受到大家广泛关注。近年来,人们发现了使用锰离子增强MRI用于活体视觉传导通路的示踪观察的方法,已有研究玻璃体注射锰离子增强MRI成像方法,正在研究锰离子液体点眼视神经增强或功能成像用于诊断和显示疾病的可行性。但锰离子局部点眼对眼表及眼前节的毒副作用尚无深入研究,本实验进行初步观察。材料与方法1实验动物及分组健康成年新西兰白兔32只,体重2-2.5千克,雌雄不限,常规裂隙灯检查排除眼部疾病,由河南省实验动物中心提供。所有实验动物的使用、饲养及处死均遵循美国视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范,且本研究经过郑州大学第一附属医院医学科研伦理委员会审核通过。将32只新西兰白兔按随机数字表法分为A、B、C、D4组,A、B、C组为实验组,D组为对照组,每组8只。实验组采用抽签法随机选取一眼为实验眼,对照组亦抽签确定一眼为生理盐水点眼对照。A、B、C组分别滴入1滴1mol/L 0.5mol/L、0.25mol/L的MnCl2滴眼液于实验眼结膜囊,D组滴入等容量生理盐水。2观察方法和评价标准观察时间点为药物滴入后1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、3d、5d、 7d、14d、21d和28d,共14个观察时间点。观察方法包括：(1)眼局部刺激反应：有无眼睑痉挛、瞬目运动有无增加,有无畏光、流泪、结膜充血水肿、分泌物增加；参照眼表刺激反应计分标准给予评分；(2)角膜荧光素染色观察角膜上皮情况；(3)角膜内皮镜观察角膜内皮计数及角膜厚度。前两项照相记录,后者打印记录。(4)组织病理学检查：在点眼后3d、7d、14d、28d分别随机处死2只实验兔,HE染色观察结膜、角膜、小梁网及睫状体病理组织学变化。观察是否出现组织水肿、炎性细胞浸润等变化。3统计学分析采用SASv9.13进行统计学分析,检验水准α=0.05。首先,分别对A组、B组、C组、D组各时间点的角膜荧光素染色评分采用Frideman检验法进行比较,两两比较采用矫正检验水准的Bonferroni法；然后分别对A组、B组、C组、D组的角膜内皮细胞密度及角膜厚度采用多组重复测量的方差分析。对A组、B组角膜厚度采用两组重复测量的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果1不同浓度锰离子滴眼液兔眼表刺激性评价的比较A组14个观察时间点评分分别为：6.0、7.0、8.0、8.0、9.0、11.0、8.0、6.0、5.0、5.0、3.0、2.5、1.0、1.0;B组14个观察时间点评分分别为：5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.5、4.0、4.0、2.5、1.5、1.0、1.0、1.0、1.0；C组14个观察时间点评分分别为：2.0、3.0、2.0、3.0、3.0、2.0、0、1.0、0、1.0、0、0、1.0、0；D组14个观察时间点评分分别为：2.0、1.0、0、0、1.0、0、1.0、0、0、1.0、0、0、1.0、0。评分与刺激程度划分：0-4分无刺激,5-9分轻度刺激,10-14分中度刺激,15-20分重度刺激。A组兔点眼后出现明显眼部刺激反应,病变在1d时达高峰,后逐渐恢复,7天后恢复正常；B组也可见明显反应,但程度较轻,计分低于A组,3d基本恢复正常：C组未见明显的眼表刺激反应。2不同浓度锰离子滴眼液点眼角膜荧光素染色结果的比较A组1h、2h、4h、6h、2h、24h、36h、48h、3d、5d、7d、14d、21d和28d14个观察时间点角膜荧光素染色结果分别为3.0(2.50,3.50)、4.0(3.50,4.50)、4.0(3.50,4.50)、4.0(3.50,4.50)、4.0(3.75,4.25)、5.0(4.25,4.75)、4.0(3.50,4.50)、3.0(2.50,3.50)、2.5(2.25,2.75)、2.0(1.50,2.50)、2.0(1.50,2.50)、1.0(0.50,2.50)、0.5(0.25,0.75)和0(0,0)；B组14个观察时间点角膜荧光素染色结果分别为2.0(1.50,2.50)、2.0(1.50,2.50)、2.5(2.25,2.75)、3.0(2.50,3.50)、3.0(2.50,3.50)、3.0(2.50,3.50)、2.5(2.25,2.75)、2.0(1.75,2.25)、1.0(0.50,1.50)、0.5(0,1.00)、0.5(0.25,0.75)、0(0.25,0.75)、0(0,0)和0(0,0)；C组14个观察时间点角膜荧光素染色结果分别为1.0(0.75,1.25)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、0(0.25,0.75)、1.0(1,1)、0.5(0.25,0.75)和0.5(0.25,0.75)；D组14个观察时间点角膜荧光素染色结果分别为1.0(1.25,1.75)、1.0(1.25,1.75)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、1.0(0.50,1.50)、0.5(0.50,1.50)、1.0(0.25,0.75)、0(0,0)和0.5(0.25,0.75)。在点眼7d内,A组、B组、C组、D组角膜荧光素染色结果评分,差异有统计学意义(p<0.05)；14d-28d,四组角膜荧光素染色评分结果差异无统计学意义(p<0.05)。A组荧光素染色见明显角膜上皮损害,14d基本恢复正常；B组角膜上皮损害较轻,3d基本恢复正常；C组可见上皮损害但很轻,3d内恢复正常。3不同浓度锰离子滴眼液对角膜内皮细胞密度及形态影响的比较A组1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、3d、5d、7d、14d、21d和28d14个观察时间点,角膜内皮细胞密度分别为(2779.8±171.7)/mm~2、(2696.3±184.9) /mm~2、(2933.5±133.9)/mm~2、(2932.9±135.8)/mm~2、(2785.8±176.6)/mm~2、 (2891.6±204.8)/mm~2、(2883.8±118.4)/mm~2、(2937.6±189.3)/mm~2 (2792.1±257.4)/mm~2、(2781.3±233.9)/mm~2、(2750.1±258.6)/mm~2 (2946.9±166.8)/mm~2、(2904.6±108.7)/mm~2和(2811.8±109.3)/mm~2;B组14个观察时间点角膜内皮细胞密度分别为(2872.6±198.4)/mm~2、(2840.9±119.7) /mm~2、(2927.3±297.0)/mm~2, (2921.7±225.8)/mm~2、(2772.6±179.9)/mm~2、 (2862.7±198.7)/mm~2、(2846.2±124.5)/mm~2、(2810.6±85.7)/mm~2、 (2846.2±124.5)/mm~2、(2749.9±142.3)/mm~2、(2726.2±155.8)/mm~2、 (2834.9± 186.2)/mm~2、(2894.8±231.5)/mm~2和(2845.2±126.7)/mm~2;C组14个观察时间点角膜内皮细胞密度分别为(2696.9±139.8)/mm~2、(2707.6±119.7) mm~2、(2919.4±127.9)/mm~2、(2956.3±133.3)/mm~2、(2802.2±113.3)/mm~2, (2872.9±142.2)/mm~2、(2867.3±126.9)/mm~2、(2870.4±179.5)/mm~2 (2792.6±202.6)/mm~2、(2812.1±169.7)/mm~2、(2771.9±198.7)/mm~2, (2905.3±125.0)/mm~2、(2871.3±93.6)/mm~2和(2832.8±74.9)/mm~2;D组14个观察时间点角膜内皮细胞密度分别为(2825.3±205.2)/mm~2、(2779.8±139.4) /mm~2、(2878.7±219.7)/mm~2、(2886.1±174.7)/mm~2、(2783.9±205.9)/mm~2、 (2885.6±135.6)/mm~2、(2781.4±122.6)/mm~2、(2840.9±149.4)/mm~2、 (2827.9±250.5)/mm~2、(2783.5±165.9)/mm~2、(2727.6±138.6)/mm~2、 (2820.0±189.8)/mm~2、(2836.4±108.9)/mm~2和(2858.7±97.5)/mm~2。四组各时间点角膜内皮细胞密度变化差异均无统计学意义(P>0.05)。角膜内皮细胞形态无明显变化。4不同浓度锰离子滴眼液对角膜厚度影响的比较A组1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、3d、5d、7d、14d、21d和28d,14个观察时间点角膜厚度分别为(0.329±0.011)mm、(0.328±0.007)mm、 (0.333±.005)mm、(0.333±0.004)mm、(0.398±0.005)mm、(0.403±0.007)mm. (0.380±0.008)mm、(0.381 ±0.009) mm、(0.345±0.018) mm、(0.330±0.005) mm, (0.332±0.018)mm、(0.321±0.007)mm、(0.319±0.006)mm和(0.317±0.004)mm；B组14个观察时间点角膜厚度分别为(0.328±0.010) mm. (0.328±0.007) mm、(0.326±0.010)mm、(0.327±0.009) mm、(0.348±0.009)mm、(0.330+0.009) mm、(0.329±0.009)mm、(0.325±0.009)mm、(0.322±0.009)mm、(0.332±0.005) mm、(0.322±0.004)mm、(0.325±0.010)mm、(0.318±0.007)mm和(0.318±0.008)mm；C组14个观察时间点角膜厚度分别为(0.318±0.004)mm、(0.319±0.005) mm、(0.319±0.004)mm、(0.322±0.006)mm、(0.320±0.004)mm、(0.321±0.004) mm、(0.321±0.004)mm、(0.323±0.004)mm、(0.322±0.003)mm、(0.321±0.003) mm、(0.322±0.002)mm、(0.320±0.003)mm、(0.320±0.003)mm和(0.321±0.003)mmm；D组14个观察时间点角膜厚度分别为(0.319±0.004)mm、(0.319±0.005) mm、(0.320±0.004)mm、(0.323±0.006)mm、(0.321±0.004)mm、(0.321±0.004) mm、(0.322±0.004)mm、(0.323±0.004)mm、(0.322±0.003)mm、(0.321±0.003) mm、(0.322±0.002)mm、(0.320±0.002)mm、(0.320±0.002)mm和(0.321±0.002)mm。A组和B组点眼后早期出现了角膜上皮层的水肿,导致角膜厚度增加(P<0.05)。C组角膜厚度未见变化(P>0.05)。5不同浓度锰离子滴眼液对兔眼结膜、角膜、小梁网、睫状体病理组织学影响的比较A组：3d时结膜可见组织水肿、血管扩张、炎性细胞浸润(包括中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞),角膜可见角膜上皮和基质层水肿,细胞体积增大,小梁网和睫状体可见炎性细胞的浸润；7d时结膜、角膜、小梁网和睫状体见类似损伤情况,但均较3d损伤轻；14d和28d,结膜、角膜、小梁网和睫状体恢复正常。B组：3d时结膜可见组织水肿、血管扩张以及炎性细胞浸润,角膜、小梁网和睫状体病理未见明显异常；7d、14d和28d时结膜、角膜、小梁网和睫状体病理均未见明显异常。C组：3d、7d、14d、28d结膜、角膜、小梁网和睫状体均未见明显异常。结论1 mol/L和0.5mol/L锰离子浓度滴眼液,对眼表及眼前节的生物毒性过大,用于人活体观察显然不可接受。而0.25 mol/L锰离子浓度无明显的眼表刺激和眼前节毒副作用,有可能用于活体视神经成像和视觉传导通路的MRI成像观察。