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舌癌作为口腔癌中最常见的一种,一般指发生在舌前2/3舌体部的恶性肿瘤,以鳞状细胞癌多见。舌部是人体的一个重要功能器官,一旦产生病变将严重影响患者的生活质量以及面部美观。本课题组前期研究表明Notch信号通路与涎腺腺样囊性癌的发生发展有着密切关系,证实了Notch1、Notch2、Notch4及其下游基因HES1、HEY1在涎腺腺样囊性癌中高表达,主要起到促癌基因作用,当抑制这些基因的表达,将导致涎腺腺样囊性癌细胞株的增殖、迁移和侵袭能力减弱而凋亡增加。Notch信号通路抑制剂尤其是γ-分泌酶抑制剂用于实体瘤的治疗已经有了大量的实验研究,然而其运用于舌癌中的实验研究较为少见。本研究在课题组前期研究的基础上,运用免疫组化法证明Notch信号通路在舌癌组织中有着高表达;将γ-分泌酶抑制剂作用于舌癌细胞株(CAL-27)从中筛选出对Notch信号通路有效的抑制剂,研究其对舌癌细胞株的增殖、凋亡及下游基因的影响情况,并对其可能机制进行初步探讨;同时将细胞学上证明有效的Notch信号通路抑制剂作用于荷瘤裸鼠,进行初步的体内实验研究。本研究可分为以下两部分进行分述:一、在舌癌组织中验证Notch信号通路的表达,并筛选出对舌癌细胞株有效的抑制剂。目的:验证Notch信号通路在舌癌组织中是否高表达;筛选出对舌癌细胞株有抑制作用的Notch信号通路抑制剂。方法:收集舌癌组织和癌旁组织的石蜡标本,应用相应抗体进行免疫组化,经2名病理科医师阅片评分后统计结果。将Notch信号通路抑制剂[BMS-906024、Avagacestat(BMS-708163)、YO-01027、LY411575、RO4929097、Compound W、BMS299897、JLK 6、Begacestat、MRK 560、MK-0752、FLI-06、Semagacestat(LY450139)]采用半对数浓度稀释后作用于舌癌细胞CAL-27,72h后运用CCK-8法检测其对细胞活力的影响,并运用Graphpad Prism5软件计算其IC50。同时运用倒置显微镜观察细胞形态学变化,从中筛选出对舌癌细胞CAL-27的活力有抑制作用的抑制剂。结果:Notch1、Notch2在舌癌组织中表达量高于癌旁组织。CCK-8法筛选出对舌癌细胞CAL-27有明显抑制作用的两种γ-分泌酶抑制剂:FLI-06和JLK 6;经计算得出FLI-06和JLK 6的IC50分别为:2.90μM、17.51μM,并且观察到实验组舌癌细胞CAL-27的形态产生明显变化。结论:Notch1和Notch2在舌癌组织中高表达。筛选出两种有效的γ-分泌酶抑制剂:FLI-06和JLK 6,它们有效抑制了舌癌细胞CAL-27的活力。二、探讨Notch信号通路抑制剂对舌癌细胞的影响。目的:探讨Notch信号通路抑制剂对舌癌细胞CAL-27的细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期及蛋白表达情况的影响。并观察Notch信号通路抑制剂治疗荷瘤裸鼠效果。方法:将第一部分筛选出有效的两种抑制剂(FLI-06和JLK 6)作用于舌癌细胞CAL-27后,分别运用CCK8法、平板克隆形成实验研究细胞增殖能力的变化;流式细胞术研究细胞周期和凋亡的改变情况;TUNEL法进一步检测细胞凋亡情况;Real-time PCR和Western blot检测相关m RNA和蛋白改变情况。建立裸鼠舌癌皮下成瘤模型后给予Notch信号通路抑制剂腹腔注射,每隔一天测裸鼠体重及瘤体大小,观察瘤体生长情况。结果:γ-分泌酶抑制剂处理CAL-27细胞后,CCK8法和平板克隆实验显示:其增殖能力受到抑制;流式细胞术发现:相比对照组实验组的早期凋亡率和晚期凋亡率均升高,并且观察到细胞周期受阻滞;TUNEL法显示:抑制剂处理组细胞凋亡率增高;Real-time PCR和Western blot法显示:抑制剂处理组相应的Notch受体及其下游基因表达下调。接种舌癌细胞后裸鼠成瘤率达100%;予以荷瘤裸鼠Notch信号通路抑制剂后,给药组瘤体体积小于对照组瘤体体积。结论:经筛选出的两种γ-分泌酶抑制剂(FLI-06和JLK 6)有抑制舌癌细胞CAL-27的增殖,阻滞细胞周期并且使细胞的凋亡率升高,同时抑制了Notch通路相关m RNA和蛋白的表达。Notch信号通路抑制剂FLI-06能够抑制裸鼠体内舌癌细胞移植瘤的生长。