研究背景和目的热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)是一个高度保守的分子伴侣,在脊椎动物中有四个亚型,包括胞质中的Hsp90α和Hsp90β,内质网中的葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94,Grp94)以及线粒体中的肿瘤坏死因子受体相关蛋白 1(tumor necrosis factor receptor-associated protein1,Trap-1)。HSP90与多种疾病的发生有关,HSP90的抑制剂已被应用于治疗癌症、神经退行性疾病、病毒和真菌感染等疾病。目前关于HSP90抑制剂的研究主要集中在对胞质中的Hsp90α/β的抑制作用上。位于内质网中的Grp94发挥与Hsp90α/β不同的功能,可以参与内质网的蛋白折叠、蛋白质量控制、调节Ca2+稳态以及细胞的免疫反应等。此外,Grp94与肿瘤、青光眼等疾病的发生有关,已成为临床治疗的潜在靶点,因此亟待开发Grp94的亚型选择性抑制剂。作为动脉粥样硬化的主要致病因子,氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)会诱导血管内皮细胞自噬。自噬在真核细胞中高度保守,是一个将细胞中多余的或具有潜在毒性的物质运送到溶酶体中降解的过程。自噬对细胞的存活具有双向的调控作用:基底水平的自噬促进细胞存活;而过度的自噬则会促进细胞死亡。因此,可以通过调节自噬稳态抑制oxLDL所引起的血管内皮细胞损伤。内质网应激参与调节自噬的发生,并且可以诱导Grp94的表达。研究发现,OxLDL可以通过激活内质网应激诱导自噬并且升高Grp94的表达水平,而Grp94是否参与调节oxLDL诱导的血管内皮细胞自噬尚不清楚。此外,自噬失调与心血管疾病、癌症和神经退行性疾病等的发生有关。OxLDL引起的血管内皮细胞损伤会促进动脉粥样硬化的发展和斑块的不稳定,并且在晚期动脉粥样硬化斑块中Grp94的蛋白水平升高,而Grp94是否参与调节动脉粥样硬化尚不清楚。在肿瘤发生发展的不同阶段,自噬起到双向的调节作用。目前认为自噬可以抑制肿瘤的发生,但是会促进肿瘤细胞生长和耐药性的产生。HSP90在肿瘤细胞中的表达量是正常细胞的2-10倍,与肿瘤的发生发展密切相关。此外,HSP90通过影响客户蛋白Akt、Beclin1、ULK1和溶酶体相关膜蛋白2A等参与调节自噬。HSP90抑制剂可以同时引起多种肿瘤相关蛋白的降解抑制肺癌细胞生长,而HSP90对肺癌细胞生长和自噬的调节机理尚需进一步阐明。香豆素支架在HSP90抑制剂开发中起到重要作用,化合物的构效关系表明香豆素的C-4,C-7和C-8在HSP90的抑制中起关键作用。在之前的研究中,我们合成了一种新型香豆素吡唑啉衍生物DPB能够抑制HSP90的活性。通过增加化合物的结构多样性和水溶性,我们合成了香豆素吡唑啉衍生物HCP1-HCP6,从中筛选到HCP1可以抑制HSP90的活性,并且在低浓度时选择性抑制Grp94。利用HCP1我们探究了 Grp94对oxLDL诱导的血管内皮细胞自噬和HSP90对A549肺癌细胞自噬的调节作用和分子机制,并且检测了 HCP1对动脉粥样硬化和肺癌的抑制作用。因此,我们的研究进一步阐明了 HSP90家族蛋白对自噬的调节机制,并且为动脉粥样硬化和肺癌的治疗提供了新靶点和新思路。研究内容1.鉴定抑制HSP90家族蛋白活性的香豆素吡唑啉衍生物。2.低浓度的HCP1抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞自噬的分子机制研究。3.HCP1对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用研究。4.高浓度的HCP1抑制A549肺癌细胞生长和自噬的分子机制研究。研究方法1.免疫荧光染色检测化学小分子与蛋白、蛋白与蛋白在细胞内的共定位情况以及蛋白在细胞内的分布情况。2.表面等离子体共振实验检测化学小分子与蛋白的结合情况。3.Western blot检测相关的蛋白水平及蛋白磷酸化水平的变化。4.通过RNA干扰或基因敲除降低细胞内特定蛋白的表达;通过过表达升高细胞内特定蛋白的表达。5.通过定点突变构建Grp94位点3的突变过表达载体,c-Myc-Grp94-wt,c-Myc-Grp94-mt1,-mt2,-mt3 和-mt4,明确 HCP1 和 Grp94 的结合位点。6.SRB实验测定细胞存活率。7.免疫共沉淀实验检测蛋白与蛋白的相互作用。8.ApoE-/-小鼠高脂喂养建立动脉粥样硬化模型,检测HCP1对动脉粥样硬化的影响。9.Hoechst 33258染色、TUNEL染色检测细胞凋亡率。10.Masson染色检测斑块中的胶原含量;免疫荧光染色检测斑块中平滑肌细胞和巨噬细胞的含量;原位明胶酶谱法检测斑块中MMP-2/9的活性。11.利用乳酸脱氢酶试剂盒检测细胞培养上清中LDH的活性。12.利用鸡胚尿囊膜模型,检测HCP1对肿瘤生长和凋亡的影响以及HCP1对血管生成的影响。研究结果1.新型香豆素吡唑啉衍生物HCP1抑制HSP90家族蛋白的活性1.1香豆素吡唑啉衍生物HCP1-HCP6均以浓度依赖的方式抑制HSP90和其抗体的结合。其中,HCP1发挥抑制作用的浓度最低(5μM)。1.2 HCP1在细胞内与Grp94存在共定位,不与线粒体共定位。表面等离子体共振结果表明HCP1直接与Grp94结合,平衡解离常数(KD值)为0.923μM。HCP1可以抑制Grp94的客户蛋白integrin α2的蛋白水平以及TLR9由内质网向溶酶体的运输。过表达Grp94位点3的突变体c-Myc-Grp94-mtl可以抑制HCP1对integrin α2蛋白水平的影响。1.3低浓度的HCP1(1 μM,2μM,5μM)不影响Hsp90α/β的客户蛋白Akt,NFκB(p65)以及Hsp70的蛋白水平。而高浓度的HCP1(10μM)降低Akt和NFκB(p65)的蛋白水平。2.HCP1通过抑制Grp94抑制oxLDL诱导的HUVEC自噬2.1 OxLDL 升高 HUVECs 中 Grp94 的蛋白水平,HCP1(0.5μM,1 μM,2μM)可以抑制oxLDL所引起的HUVECs存活率降低。2.2 HCP1(1 μM,2μM)可以减少HUVECs中oxLDL诱导的LC3点状聚集数量并且降低LC3-Ⅱ的蛋白质水平,过表达c-Myc-Grp94-wt可以抑制HCP1的对LC3-Ⅱ蛋白水平的影响。2.3 Grp94 与 AMPK 相互作用,HCP1可以降低 HUVECs 中 AMPK(Thr172)的磷酸化水平,过表达c-Myc-Grp94-wt抑制了 HCP1对AMPK(Thr172)磷酸化水平的影响。2.4 HCP1可以升高mTORC1的下游底物p70S6K和4EBP1的磷酸化水平,AMPK的激活剂阿卡地新(Acadesine,AICAR)抑制了 HCP1对mTORC1活性的影响。AICAR也抑制了 HCP1对LC3-Ⅱ蛋白质水平的影响。2.5 HCP1可以抑制HUVECs中oxLDL诱导的PARP的切割水平。3.HCP1促进apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的稳定3.1 HCP1处理不影响小鼠的体重和脏器系数。3.2 HCP1处理可以减少斑块内皮层中LC3的点状聚集。3.3 HCP1处理可以抑制斑块内皮层的凋亡以及斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞的凋亡。3.4 HCP1处理增加斑块中胶原蛋白和平滑肌细胞的含量,降低基质金属蛋白酶MMP-2/9的活性,降低促炎性的M1型巨噬细胞(CD11C+CD68+)的含量,增加抗炎性的M2型巨噬细胞(CD206+CD68+)的含量。4.HCP1抑制A549细胞生长和自噬4.1 HCP1-HCP6均以浓度依赖的方式降低A549细胞的存活率。其中,HCP1处理A549细胞48h的半抑制浓度IC50(μM)值最低,为4.7μM。4.2 HCP1-HCP6处理不影响A549细胞培养上清中LDH的活性。4.3 HCP1不影响正常培养条件下HUVECs的生长。4.4 HCP1以浓度和时间依赖的方式升高A549细胞中LC3-Ⅱ的蛋白水平。HCP1还可以升高自噬的选择性底物p62的蛋白水平。溶酶体抑制剂bafilomycin A1可以抑制HCP1对LC3-Ⅱ和p62蛋白水平的影响。4.5 HCP1处理降低了 A549细胞中PEBP1(Ser153)的磷酸化水平,不影响PEBP1的蛋白水平。在HEK293T细胞中,敲除PEBP1的表达抑制HCP1对LC3-Ⅱ蛋白水平的影响。4.6 HCP1处理诱导A549细胞中染色质凝集和PARP切割水平的升高。4.7 HCP1抑制鸡胚尿囊膜移植瘤的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。HCP1不影响鸡胚尿囊膜血管的生成。结论1.香豆素吡唑啉衍生物HCP1抑制HSP90家族蛋白的活性。低浓度的HCP1(1 μM,2 μM,5 μM)通过与Grp94的位点3结合选择性抑制Grp94的活性,高浓度的HCP1(10 μM)也可以抑制Hsp90α/β的活性。2.低浓度的HCP1通过抑制Grp94抑制oxLDL诱导的HUVEC自噬。Grp94和AMPK相互作用,HCP1通过抑制Grp94抑制了 AMPK的活性,并且HCP1通过抑制AMPK-mTORC1通路抑制自噬。因此,低浓度的HCP1通过抑制Grp94-AMPK-mTORC1通路抑制了 oxLDL诱导的HUVEC自噬。3.低浓度的HCP1抑制oxLDL诱导的HUVEC凋亡和存活率降低。4.HCP1抑制apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内皮层的自噬并且可以抑制斑块细胞凋亡,提高斑块的稳定性。5.高浓度的HCP1抑制A549细胞生长,不引起细胞坏死。6.高浓度的HCP1诱导A549细胞自噬流损伤和凋亡,PEBP1 Ser153的磷酸化可能参与介导了 HCP1对自噬流的损伤作用。