目的恶性黑色素瘤是一种高度侵袭性皮肤肿瘤,其起源于黑色素细胞。黑色素瘤在全世界的发生率在逐渐增加,除了手术切除外,目前还没有更好的治疗方法,尤其对于进展期的病人。目前影响黑色素瘤发生发展的分子机制已经成为了研究的热点。有很多研究表明micro RNA在肿瘤的发生、发展中有着重要的作用,其中包括黑色素瘤。其中micro RNA149(miR-149)在人类癌症中主要作为抑制基因发挥作用。本实验成功构建了人micro RNA149(has-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤细胞增殖及迁移的影响。方法由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体p BS-h U6-1连接,将连接后的载体与慢病毒空载体FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体。再将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒(p MDLg/p RRE、p RSV-Rev、p HCMV/G)共转染至293 T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,从而获得感染时的感染复数(MOI),即感染时病毒与细胞数量的比值。再根据感染复数,将包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-149表达水平,同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力。结果成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确。在荧光显微镜下观察到转染后的297 T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010 TU/L。将病毒感染黑色素瘤Mel-RM细胞发现可有效降低miR-149的表达水平(P<0.05)。MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P<0.05)。细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P<0.001)。结论成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移。本实验为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据。