论文部分内容阅读
目的研究不同浓度氟对体外培养人脐静脉血管内皮细胞的损伤作用;不同浓度硒对体外培养人脐静脉血管内皮细胞生长的影响;不同浓度的硒对不同浓度氟造成的血管内皮细胞损伤的拮抗作用。为硒拮抗氟致动脉硬化的应用提供理论依据。方法人脐静脉血管内皮细胞（Human umbilical vein endothelialcells,HUVEC）置于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养。待细胞处于对数生长期,进行实验。实验分组分为加氟组、加硒组、加氟加硒组。加氟组氟化钠（NaF）浓度分别为0、100、400、700、1000、2000μmol/L。加硒组亚硒酸钠（Na2SeO3）的浓度分别为0、50、100、500、1000、2000nmol/L。加硒加氟组氟化钠（400、700、1000、2000μmol/L）+亚硒酸钠（100 nmol/L）。连续培养48h后收集细胞培养液与细胞待用。瑞氏-吉姆萨染色（Wrigh-Giema staining）观测细胞形态,吖啶橙荧光染色（Acridine orang staining）测定细胞凋亡的情况。采用四唑盐（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法测定细胞活性;检测培养液中谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase,GSH-px）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的活性。检测培养液中诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxidesynthase,iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxidesynthase,eNOS）的活性和浓度。采用酶联免疫吸附试验（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA）测定培养液中的细胞粘附因子（Intercellularcell adhesion molecule-1,ICAM-1）和血管粘附因子（Vasular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1）的表达。采用逆转录聚合酶连反应（Reversetranscription polymersade chain reaction,RT-PCR）为,测定iNOS-mRNA、eNOS-mRNA的表达。结果采用多组间比较采用方差分析,两两比较采用q检验。结果1氟对血管内皮细胞损伤作用1.1细胞形态学观察瑞氏-吉姆萨染色发现加氟组细胞随着氟剂量增加数量开始减少,形态变化明显;血管内皮细胞的数量随着浓度增大而减少,内皮细胞中出现似成纤维细胞样改变,,细胞间隙增大。随着NaF浓度增大,变形的细胞所占得比例越大。吖啶橙染色NaF浓度达到2000μmol/L时,细胞核有明显变形,聚集在细胞边缘,呈月牙形排列,并有少许荧光碎片1.2氟化钠对细胞生长的影响HUVEC给予NaF处理后48h后,MTT法测定细胞增值,在低浓度NaF,对细胞的生长几乎没有作用（P＞0.05）,当NaF浓度为700、1000μmol/L时,可以明显抑制细胞得生长（P＜0.05）。当浓度为2000μmol/L时抑制的作用更强。1.3氟对培养液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响氟的剂量为100μmol/L时,SOD、GSH-px、MDA的活性或者是浓度都没有显著变化（P＞0.05）。随着NaF浓度增大,SOD、GSH-px的活性明显的降低（P＜0.05）,而MDA的浓度则明显的升高（P＜0.05）。1.4氟对内皮细胞eNOS和iNOS表达的影响低浓度氟对eNOS影响不大（p＞0.05）,随着氟浓度增大eNOS的活性逐渐减弱（p＜0.01）。而iNOS的活性则随着氟浓度的增高逐渐的增强（p＜0.01）。RT-PCR检测细胞eNOS mRNA和iNOS mRNA水平的变化,HUVEC与低浓度氟作用以后,其eNOS和的RT-PCRiNOS产物没有明显变化,但在氟浓度增大后具有统计学意义（P＜0.05）。1.5检测培养液中ICAM-1和VCAM-1浓度当NaF浓度时,培养液中的ICAM-1和VCAM-1的浓度并没有显著变化（P＞0.05）。当氟浓度增大,在400-2000μmol/L时,培养液中两种粘附因子的浓度都明显的增大,统计学检验有显著的统计学意义（P＜0.05）。2硒对血管内皮细胞的影响通过研究硒对内皮细胞形态、细胞活性、培养液中SOD、GSH-px活性和MDA含量、内皮细胞eNOS和iNOS表达、内皮细胞的ICAM-1和VCAM-1表达的影响,确定硒在浓度为100nmol/L时对细胞明显有保护作用,从而确定硒的干预剂量为100nmol/L。3硒对氟造成血管内皮细胞损伤的干预作用3.1硒对氟造成细胞形态改变的影响细胞在加硒加氟的培养液中培养48 h后染色观察,氟浓度100-700μmol/L细胞形态正常;当加硒加氟组的氟浓度达到1000μmol/L时,出现零星成纤维样细胞,当加硒加氟组的氟浓度达到2000μmol/L时,与加氟组没有明显的改变,细胞形态变化较大,细胞核可见浓染致密并可见荧光碎片3.2硒对氟造成的细胞活性改变的影响MTT测定细胞活性在不同组细胞中加入不同浓度的氟和硒共同培养48h后,MTT结果显示,在氟（100-700μmol/L）+硒组时,细胞生长并不受到抑制（P＞0.05）。在氟（1000-2000μmol/L）+硒组时,细胞生长明显受到抑制（P＜0.05）。但是与只加氟相比,细胞增值都增高。3.3硒对氟造成内皮细胞培养液中SOD、GSH-PX活性和MDA浓度改变的影响与同剂量加氟组相比,在氟（400-1000μmol/L）+硒组SOD与GSH-Px在培养液中的活性明显的增高（P＜0.05）,而MDA浓度则明显的降低（P＜0.05）;氟（2000μmol/L）+硒组,SOD、GSH-Px活性和MDA浓度都没有明显的变化（P＞0.05）。3.4硒对氟造成内皮细胞NOS的异常表达的影响与同剂量加氟组相比,氟（400,700μmol/L）+硒组培养液中iNOS的活性明显的降低（P＜0.05）,而eNOS的活性则明显的增高（P＜0.05）;氟（1000,2000μmol/L）+硒培养液中eNOS和iNOS活性没有明显的变化（P＞0.05）。RT-PCR测定结果显示,与同剂量加氟组比较,氟（400-1000μmol/L）+硒组iNOS mRNA表达明显的降低（P＜0.05）,而氟（2000μmol/L）+硒组iNOSmRNA的表达没有明显的变化;氟（400,1000μmol/L）+硒组的eNOS mRNA表达明显增高（P＜0.05）,而氟（2000μmol/L）+硒组eNOS mRNA的表达没有明显变化。3.5硒对氟造成内皮细胞黏附因子异常表达的影响与同剂量加氟组比较,氟（400-1000μmol/L）+硒组培养液中ICAM-1和VCAM-1的浓度明显降低（P＞0.05）,氟（2000μmol/L）+硒组培养液中ICAM-1和VCAM-1的浓度则没有明显变化（P＞0.05）。结论1、高浓度氟可以使内皮细胞的形态发生改变,并且可以导致细胞的调亡;适量剂量硒可以拮抗氟化钠对细胞的损伤。2、氟可以使培养液中的GSH-Px,SOD活性降低,使MDA的含量增高;适量浓度的硒可以改善这种现象,使SOD、GSH-Px活性明显升高,MDA浓度下降。3、氟可以抑制eNOS mRNA的表达,使培养液中的eNOS活性降低;可以刺激iNOS mRNA的表达,使培养液中iNOS活性增强;适量浓度硒可以抑制氟对细胞eNOS和iNOS的刺激,使eNOS和iNOS的表达和活性趋于正常。4、氟可以激活内皮细胞的粘附因子的表达,使培养液中ICAM-1和VCAM-1的含量增高;适量浓度硒可以抑制氟对细胞黏附因子的刺激,使其在培养液中的浓度明显的低于只加氟的实验组