论文部分内容阅读
研究背景及目的：恶性肿瘤治疗手段的贫乏及治疗的无效性困扰着临床肿瘤学领域,问题的关键在于传统治疗手段缺乏特异性以及由此导致的系统用药时药物使用剂量的限制等。研究人员对此尝试了各种新方法,期望能最终解决这个问题。近年的研究成果表明,间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)具有对恶性肿瘤的内在趋向性和低免疫原性的特点,因而,它们最近作为“特洛伊木马”将治疗性手段如基因载体或药物直接送入特定的肿瘤组织,同时可以携带影像对比剂用于细胞示踪和实时的肿瘤监测。MSCs作为载体,可以解决恶性肿瘤原来诊治中的诸多难题如载体和转基因的免疫原性问题、靶向性问题、安全性问题等,已经在一些研究中显示了良好的效果,可以预见其在未来的肿瘤诊治中具有广泛的应用前景。细胞载体的体内运用,需要一种良好的体内细胞示踪技术。磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)由于其组织及空间分辨率高、对软组织显像较好、可多角度多序列成像已迅速成为临床最受欢迎的无创性的检测手段。随着MR影像对比剂特别是近年来超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticle, SPION)技术的飞速发展,已经成为体外标记MSCs体内示踪治疗的最佳选择。SPION(核心部分的晶体氧化铁是磁敏感物质),作为负性影像对比剂标记移植细胞(细胞内标记或者细胞表面标记)能在MRI下显著降低T2WI和T2*WI图像信号,明显区分移植细胞和原位组织细胞,从而间接反映移植细胞的分布和迁移情况。当前已被FDA批准临床应用的SPION如Ferumoxides (Endorem(?)-欧洲,菲立磁(?)美国和日本)和Ferucarbotran (Resovist(?)-欧洲和日本)等主要用于临床上网状内皮细胞系统(reticuloendothelial system,RES)的短期显像,Kuffer细胞、巨噬细胞对外界颗粒的吞噬能力较强,包裹材料葡聚糖或其衍生物较易在体内代谢消除。但是对于非吞噬细胞MSCs的标记而言,摄取这些SPION的能力相对较弱导致单位细胞的载铁量不足且其分裂速度较快导致单位细胞的载铁量迅速稀释,因而,现有的SPION显然难以满足长期动态MR监测MSCs的影像对比剂要求。本课题鉴于MSCs分子影像标记的迫切需求,基于国际SPION细胞标记的研究进展和发展趋势,拟设计合成一种新型的SPION (SPIO@SiO2-NH2),特别用于标记和MR示踪具有较强分裂能力的非吞噬细胞MSCs。新型SPION (SPIO@SiO2-NH2)的设计理念如下：(1)晶体Fe3O4作为新型SPION的核心,使其具有超顺磁性；(2)外包裹材料SiO2使新型SPION具有良好的亲水性、稳定性、分散性和生物相容性,同时由于其理化和生物学上的惰性可以逃避细胞内溶酶体中酶性成分和酸性成分对SPIO@ SiO2-NH2的降解实现细胞内的长期存在；(3)在SiO2材料外添加NH2基团(生理pH下带正电荷)可以与细胞膜上的负电荷产生静电效应,提高细胞对新型SPION的吞噬,从而提高单位细胞的载铁量实现良好的MR显像；(4)直接使用3-氨丙基三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)triethoxysilane,APTES)对制备出来的晶体氧化铁核心进行了表面修饰,较薄的SiO2包裹层对颗粒饱和磁感应强度的影响较小。实验内容和方法：(1)使用共沉淀法制备出分散性较好的晶体氧化铁核心,直接使用APTES对制备出来的晶体氧化铁核心进行了表面修饰,制备出表面具有氨基功能团的SPIO@ SiO2-NH2;(2)采用透射电镜(Transmission Electronic Microscopy, TEM)、X线衍射谱分析(x-ray powder diffraction, XRD)、磁感应强度检测、弛豫率检测鉴定新合成颗粒的理化性质；(3)采用贴壁法从兔骨髓中分离筛选出MSCs,新型SPIO@ SiO2-NH2体外标记MSCs;(4)采用普鲁士蓝染色法、电感耦合等离子体发射光谱仪(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer,ICP-OES)、MR检测等验证SPIO@ SiO2-NH2体外标记MSCs的效果(短期和长期)；采用台盼蓝染色法检测颗粒对MSCs活力的影响,采用MTT法检测颗粒对MSCs增殖的影响,同时检测颗粒对MSCs分化潜能的影响；(5)建立兔脑损伤模型和竖脊肌损伤模型,直接局部输注SPIO@SiO2-NH2标记的MSCs,MR长期动态监测MSCs,监测完成后采用组织切片的HE+普鲁士蓝共染色检测细胞和颗粒在组织局部的转归。实验结果：(1)成功合成了一种新型多面体形SPION(SPIO@SiO2-NH2),同时合成SPIO@SiO2作为对照；(2)SPIO@SiO2-NH2呈多面体形、6-11nm、超顺磁性其磁感应强度和弛豫率分别为52.5 emug-1Fe和43.5±9.1 mm-1 s-1：(3)成功分离筛选出兔骨髓来源的MSCs,SPIO@SiO2-NH2以4.5μg[Fe]/mL浓度孵育16h可以作为良好的标记条件(无需添加转染试剂)；(4)4.5μg[Fe]/mL浓度的SPIO@ SiO2-NH2可以高效标记MSCs,MSCs吞噬后存在于细胞浆的溶酶体或囊泡内,载铁量为68.7±11.2 pg/cell(而同等铁浓度的SPIO@SiO2为17.4±3.9 pg/cell),3.0T的MRI下的最低检测阈值为1000个MSCs(同等铁浓度的SPIO@SiO2为5000个MSCs);标记后的MSCs活力、增殖能力和三系分化潜能(成骨、成脂、成软骨分化)未受明显影响,TEM未发现明显的凋亡和坏死现象；SPIO@SiO2-NH2标记33d后,TEM仍可发现溶酶体和囊泡中存在少量的铁颗粒,3.0T的MRI下的最低检测阈值为10000个MSCs(同等铁浓度的SPIO@SiO2为50000个MSCs);(5)成功建立兔脑损伤模型和竖脊肌损伤模型,直接局部输注SPIO@SiO2-NH2标记的MSCs,MRI显像良好并且可以对MSCs实现长期(8-12w)动态监测,发现有MSCs的迁移,组织切片的HE+普鲁士蓝共染色检测显示蓝染颗粒存在于输注细胞内,但是对于其是否发生了分化以及分化的细胞类型尚不明确。结论：(1)成功合成新型多面体形SPIO@SiO2-NH2和SPIO@SiO2纳米颗粒。(2)理化检测结果表明,SPIO@SiO2-NH2具有良好的超顺磁性和核磁应用特征(饱和磁感应强度和T2弛豫率)。(3)两种SPION颗粒均能在体外有效标记MSCs,同时不影响MSCs的活力、增殖能力和分化潜能。SPIO@siO2-NH2和SPIO@SiO2均能在不影响MSCs的活力、增殖能力和分化潜能下,体外以较低的铁浓度有效标记兔骨髓来源的MSCs,而SPIO@SiO2-NH2表面的胺基修饰能显著增强MSCs的体外标记效率。(4)SPIO@SiO2-NH2标记的MSCs直接输注动物模型,可以通过MRI实现体内的长期动态监测(2-3m)SPIO@SiO2-NH2的胺基修饰能显著增强MSCs对颗粒的吞噬效率。(5)长期标记结果表明标记的MSCs存在迁移。