在人类历史上,传染病一直是全球威胁生命健康的严重问题之一。抗生素的发现和发展对人类对抗传染性疾病产生了变革性影响。然而,由于抗生素滥用,细菌已进化出各种策略逃避其杀灭作用,使多重耐药菌感染治疗成为严峻的挑战。金黄色葡萄球菌是临床常见病原体,可引起多种浅表皮肤感染和全身性疾病（心内膜炎和化脓性关节炎）。近年流行病学数据显示,医院和社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染数量急剧增加。因此,探索抗生素的替代品成为世界急需解决的难题。抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）的广谱抗菌活性、低耐药性和免疫原性,使其成为极有前景的治疗细菌感染的抗生素替代品。课题组前期从海南沼蛙（Hylarana guentheri）克隆得到天然抗菌肽temporin-GHa（GHa）。为提高GHa的治疗潜力,我们结合模板设计法和数据库辅助设计法优化设计新型抗菌肽。生物信息学统计数据显示temporin抗菌肽中K的频率显著高于R和H,我们使用K分别在其两端的组氨酸进行的单点和多点保守突变,得到GHa K、GHa4K和GHa11K。抗MRSA肽和抗生物被膜肽的氨基酸谱中R的频率显著变高,为定向改造获得具有高效抗MRSA和抗生物被膜肽,用R替换K,获得GHaR、GHa4R和GHa11R。活性筛选发现衍生肽的抗菌谱增大,活性增强。衍生肽对金黄色葡萄球菌活性最强,精氨酸突变体对MRSA的活性强于赖氨酸突变体。K系列突变体对金黄色葡萄球菌的抗菌活性强于GHa,在亚MIC浓度即能抑制金黄色葡萄球菌的生长,杀菌速率快。荧光光谱结果表明GHa和衍生肽与细菌膜相互作用发挥其抗菌活性,并且衍生肽引起的膜渗透速率更快。MTT实验证实衍生肽抗生物被膜活性比母肽增强了4至8倍。肽的溶血活性和对人细胞的毒性测定作为评估其安全性的指标。与亲本肽相比,衍生肽的治疗指数（Therapeutic index,TI）增加了4-8倍,细胞选择性指数（Cell selectivity index,CSI）也增加了2-4倍。所有肽对人正常细胞系HL-7702均表现出极低的细胞毒性。圆二色谱显示衍生肽保持了亲本肽的α-螺旋结构。定向改造获得的抗MRSA肽GHaR和GHa11R在高温、酸碱性及阳离子(Na+和Ca2+)的条件下稳定,且具备良好的蛋白酶抗性和血清稳定性。生长抑制曲线和杀菌曲线显示衍生肽具有更快速高效的抗菌作用。荧光光谱法和荧光显微镜观察一致表明GHaR可快速破坏细菌膜结构完整性,而GHa和GHa11R对MRSA仅诱导了小程度的细胞膜损伤。扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察到GHaR可使MRSA细胞膜结构完全破坏,GHa和GHa11R对MRSA细菌形态破坏轻微。细胞质膜电位测定表明GHa和衍生肽可使MRSA膜电位去极化。凝胶阻滞实验显示衍生肽能与细菌DNA结合。耐药性诱导实验发现MRSA对衍生肽相比万古霉素不易产生耐药性,这可能与衍生肽多靶点作用机制有关。MTT实验表明,与GHa相比,衍生肽抑制MRSA初始贴附、生物被膜形成和清除成熟生物被膜的能力显著提高。激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）表征实验显示GHaR有效抑制了生物被膜的形成,而GHa和GHa11R抑制作用较弱。8×MIC的GHaR和GHa11R均能完全破坏成熟的生物被膜,但作用机制不同。非水溶性胞外多糖含量测定发现GHa对MRSA非水溶性胞外多糖（Extracellular polysaccharide,EPS）的抑制作用较小,GHaR可显著抑制MRSA非水溶性EPS合成而降低细菌的粘附力,从而抑制生物被膜形成。CCK-8方法评估了肽的细胞毒性。所有肽对人正常细胞系HL-7702均表现出较低的细胞毒性,溶血活性结果表明GHaR和GHa11R的CSI值显著增大,体现了其宽泛的治疗窗口,降低了治疗风险。为了在高活性的基础上再进一步降低毒性,本研究以活性最优的GHaR为模板进行改造得到GHaR6R、GHaR7R、GHaR8R、GHaR9R和GHaR9W。抗微生物活性和溶血活性实验表明,GHaR6R、GHaR8R、GHaR7R和GHaR9W保留了较强的抗菌活性。GHaR6R、GHaR8R和GHaR9W的溶血活性降低显著,具有较高的细胞选择性,GHaR9R虽然降低了溶血活性,但其活性也降低。本研究优化设计的K突变体和定向改造的GHaR和GHa11R是治疗金黄色葡萄球菌和MRSA感染有应用前景的新型抗菌药候选物。GHaR6R、GHaR8R和GHaR9W三个高效低毒的衍生肽也将是具有研究价值的先导化合物。本研究为设计高效低毒的抗菌肽提供理论依据和策略。