多重原位杂交技术能够对RNA的表达丰度和空间位置进行检测,这为基因研究提供了新的思路。本文旨在开发一种基于锁式探针的新型单分子RNA多重原位检测技术,拟解决目前多重原位检测方法操作步骤繁琐、基于逆转录的单分子RNA多重原位检测效率低下以及可用光谱分辨的荧光染料的数量有限等问题。首先,我们对新型单分子RNA多重原位检测在乳腺癌细胞中的不同mRNA原位检测进行了探索。对应用于多重原位检测的新型锁式探针的设计进行了尝试,与以往探针不同的是我们通过在锁式探针上的三个位置插入条形码DNA片段,每个序列对应一个独特的荧光标记检测探针,通过在三轮检测之后,理论上可以对于64种基因进行多重检测;其次,我们在SK-BR-3、MDA-MB-231和T-47D这3种乳腺癌细胞系上对相关基因如HER2、ESR1、PGR及MKI67等完成了多达39种基因的多重检测,其结果显示,ESR1和PGR这两个基因在T-47D上的信号检出量最高,而HER2和MKI67这两个基因则分别在SK-BR-3和MDA-MB-231上有最高的信号检出量,结果和人类蛋白质图谱计划中的结果一致。此外,我们将SK-BR-3和T-47D中待测基因的多重原位杂交表达数据与HPA数据库中显示的TPM值相关联,并将MDA-MB-231中具有FPKM的表达数据与RNA-seq进行关联以进行相关性验证,也显示出本方法所得结果与测序数据具有良好的相关性(P值均小于0.01)。其次,基于上述结果,我们将本方法应用于石蜡包埋的乳腺癌组织样品,定量分析了三种不同乳腺癌组织样本的39种不同mRNA的表达,实现了较理想的原位多重检测效果。检测到的mRNA在整个组织中显示出不同的定位模式,并且检出的信号量也有所不同。在肿瘤细胞密集分布的肿瘤区域中很容易检测到许多mRNA信号点,但在邻近的基质中却没有。这也说明了我们的方法具有良好的特异性。最后,我们利用本方法分析蚂蚁脑组织切片中的基因表达。首先针对蚂蚁的多个管家基因设计探针并实现检测,证实我们的实验方案在蚂蚁脑中的可行性;其次,通过对于蚂蚁蘑菇体前端和后端切片以及不同级别的蚂蚁的蘑菇体切片进行检测,获得了不同的mRNA表达模式。这也证明了它们在神经科学应用中的巨大潜力。综上所述,由于本方法具有较高的检测效率、特异性及广泛的适用性,因次本方法有望应用于基础生物学和基础医学中RNA水平的基因表达研究,通过进一步地发展,该技术平台更有望成为一种新的临床诊断工具。