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茵陈具有清湿热,退黄疸的功效,是中医自古以来治疗黄疸的要药。春季采收的茵陈幼苗,习称“绵茵陈”;秋季花蕾期采收,称“茵陈蒿”。其主要成分有6,7-二甲氧基香豆素,绿原酸,咖啡酸等。全草含挥发油,其中主要成分为β-蒎烯、茵陈炔、茵陈烯酮、茵陈色原酮、对羟基苯乙酮等。茵陈具有利胆、保肝、抗肿瘤、抗病原微生物、解热镇痛抗炎等功效。在临床上主要用于黄疸尿少,湿疮瘙痒;传染性黄疸性肝炎。国内的研究多集中于药效学方面,国外的研究重点在于物质基础及作用机理研究。寻找特异性保肝效应成分仍然是我们研究的主要目标。
在茵陈蒿保肝作用的物质基础研究方面,本实验第一部分研究建立了细胞固相色谱法,首先用阳性药验证了该方法的可行性和可靠性,然后以茵陈蒿作为模型药物进行保肝作用物质基础研究。实验发现利用肝细胞固相色谱法能够找出茵陈蒿中6个与肝细胞结合的成分(峰A-F),六个峰中的D为7-甲氧基香豆素,C、E、F由于含量很低,暂未进行分离鉴定。分离提取了两个与肝细胞结合的单体成分样品A和样品B,进一步采用H2O2肝细胞损伤模型、CCl4肝细胞损伤模型来验证这两种单体成分的保肝效应,发现样品B具有显著的保肝效应,表明茵陈蒿的保肝途径之一是直接对肝细胞的保护作用。这部分研究证实了肝细胞色谱法可用于寻找中药及复方中保肝效应物质基础,是中药物质基础研究的新方法,新思路。
前一部分分离出的样品量少,要更进一步对活性成分进行研究,就需要从茵陈蒿中分离提取出更多所需的成分。由此产生一个问题,在对茵陈蒿药材的文献查阅中,发现《中国药典》收载茵陈入药有两种形式:一是春季采收的幼苗,习称“绵茵陈”;一是秋季花蕾期采收,称“茵陈蒿”。我国常用绵茵陈入药,而日本、韩国常用秋季带花实的枝梢入药。文献研究发现茵陈的化学成分随着季节的变化而发生改变,然而目前尚缺少系统的绵茵陈与茵陈蒿的药效学比较研究以及由于君药的不同采收季节引起的复方茵陈蒿汤药效的变化研究。本文试图以此为切入点,研究不同采收季节茵陈的药效和成分差异,为我们下一步分离提取活性成分提供科学依据,同时也为其他的研究者提供参考。
本实验第二部分以幼苗期的绵茵陈、带花实期的茵陈蒿作为研究对象,从两个方面分析差异,首先从药理效应的角度来研究绵茵陈和茵陈蒿在保肝药效上的差异,以及以绵茵陈为君药的茵陈蒿汤I和以茵陈蒿为君药的茵陈蒿汤II之间的保肝药效差异,同时采用高效液相色谱法比较两者在成分上的差异。
药理效应研究中采用CCl4小鼠肝损伤模型,通过检测血清中ALT、AST;肝组织匀浆中MDA、SOD的含量变化以及肝脏病理变化等指标来综合反应绵茵陈和茵陈蒿及茵陈蒿汤I、茵陈蒿汤II对小鼠肝损伤的保护程度。模型组ALT、AST、MDA显著升高;SOD显著下降。用药各组ALT、AST、MDA低于模型组;SOD高于模型组。形态学可见用药各组小鼠肝脏损伤面积比模型组要小。药效实验结果说明绵茵陈与茵陈蒿单味药及复方对小鼠CCl4肝损伤具有不同程度的保护作用。
成分分析的高效液相色谱法结果表明绵茵陈和茵陈蒿的成分差异较大(280nm):1)茵陈蒿的指纹图谱中共有24个主要峰,绵茵陈中共有18个主要峰。2)在茵陈蒿的指纹图谱中,有9个峰是绵茵陈中没有的,其中5个峰(峰4、13、21、23、24)成分的含量比较高;在绵茵陈的指纹图谱中,有3个峰(峰1、10、15)是茵陈蒿中没有的,成分含量均较高。3)二者有15个共有峰(a-o),峰c、d、i、j、k、l、m、n、o在茵陈蒿中的相对面积明显大于绵茵陈。4)标准品6,7-二甲基香豆素、绿原酸、咖啡酸在图谱中分别对应了峰j、f、h,属于绵茵陈和茵陈蒿的共有峰。茵陈蒿中6,7-二甲基香豆素的含量高于绵茵陈。绵茵陈中咖啡酸、绿原酸含量略高于茵陈蒿。结合第一部分肝细胞色谱的研究,得知前面所得的保肝样品B在绵茵陈和茵陈蒿的指纹图谱中对应的是共有峰n,样品B在茵陈蒿中的含量大于绵茵陈。
绵茵陈与茵陈蒿二者在成分上的差异,一方面体现在效应强度的差异,如6,7-二甲氧基香豆素[2]是保肝活性较强的成分,我们所提取出的样品B的亦具有较强的保肝活性。另一方面提示了二者作用途径和机制可能有差别。具体的成分与效应之间的关系有待进一步研究。
综上所述,本实验证实了肝细胞固相色谱法在茵陈蒿物质基础研究中的可行性,证实了茵陈蒿中的某些成分具有直接的肝细胞保护作用。通过对绵茵陈和茵陈蒿的保肝效应的比较研究,证实了二者及其复方对CCl4肝损伤小鼠均具有一定程度的保护作用;同时通过对绵茵陈和茵陈蒿的成分比较,分析出二者在成分上的差异,包括保肝成分6,7-二甲氧基香豆素、样品B的含量差别,提示二者效应强度和作用途径和机制可能有差别。