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IFN-γ(又称免疫干扰素、Ⅱ型干扰素)是细胞免疫应答的主要介导者,在抗原或者非特异性有丝分裂原的刺激下主要由固有免疫系统的NK细胞和NKT细胞,以及获得性免疫应答系统的CD8+和CD4+Th1效应T淋巴细胞分泌。IFN-γ具有抗病毒和胞内感染、抗肿瘤和广泛的免疫调节活性等广谱且复杂的生物学功能。IFN-γ在调节免疫应答,特别是防御胞内菌感染的Thl型免疫应答的诱导和维持方面起着重要作用。分泌IFN-γ的T淋巴细胞的出现是Thl型免疫应答的特征性表现,通常把生物样本中IFN-γ的水平、或者合成IFN-γ细胞总量作为进行性Thl型免疫应答的指示器。因而,定性或定量检测生物样本中IFN-γ的水平可以反映胞内感染(比如分枝杆菌、李斯特菌、衣原体等病原感染)情况。高特异性的、与天然BoIFN-γ (bovine interferon-gamma,牛Y干扰素)反应的BoIFN-γ单克隆抗体可以作为配体纯化天然BoIFN-γ和各种重组BoIFN-γ作为研究工具来研究牛IFN-y生物学活性和体内免疫调节作用,或者依此建立各种免疫学检测方法(如抗原捕获ELISA、ELISPOT、Immuno-PCR、ICC等)来检测生物样本中BoIFN-γ的水平,从而评价机体细胞免疫状态,以及诊断或辅助诊断疾病(如结核病、副结核病等)。为此本研究制备出了高特异性、与天然BoIFN-γ反应的BoIFN-γ单克隆抗体,为上述研究奠定了最基本的物质基础。以纯化的rHis-BoIFN-γ为免疫原免疫6周龄BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以rGST-BoIFN-γ为检测原,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次亚克隆后,共获得30株稳定分泌针对原核表达BoIFN-γ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4.1D2、1D5、1E7、1G5、1H2、1H5、2B4、2B12、2D7、2D8、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、3E3.3E9.3F1、3F2、4C8、4D3、5B8、5F5、6C7、6E8、7A6、7D10和7E5。亚类鉴定结果显示1B4、1D2、1D5、1E7、1H2、2B12、2D7、2D8、2G5、3C12、3E3、3F1、3F2、4C8、4D3、5F5和6E817株单抗为1gGl、1G5、1H5、2B4、2E2、2E3、3A8、3A10、3E9、5B8、7A6和7E511株单抗为IgG2a,6C7和7D10两株为IgG2b。间接ELISA测定效价结果显示,除1H2和3F1上清效价为1：1280,588为1：2560较低外,其他27株单抗上清效价均在1×104～8×104之间,30株单抗腹水效价均在2×106～1.6×107之间。在Western blotting分析试验中,1B4、1D2、1E7、1G5、1H2、1H5、2B12、2D8、2E2、2E3、2G5、3E3、3E9、4D3、5B8和6C7等16株单抗均与23KDarHis-BoIFN-γ和43KDa rGST-BoIFN-γ重组蛋白发生反应,出现特异性条带。以BoIFN-γ标准品为抗原的间接ELISA显示,1B4、1D2、1E7、lG5、1H2、2B12和2D87株单抗细胞培养上清OD值较低,近于阴性；1D5、1H5、2B4、2D7、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、3E3、3E9、3F1、3F2、4C8、4D3、5B8、5F5、6C7、6E8、7A6、7D10和7E523株均呈明显的阳性反应。特异性试验结果显示,大部分单抗与rHis-CerlFN-γ (cervus interferon-gamma,梅花鹿γ干扰素)具有交叉反应,除此之外,单抗只与BoIFN-γ发生反应,30株单抗均不与原核表达的其他除rHis-CerlFN-γ以外的重组细胞因子及对照菌反应。以重组杆状病毒Bacmid-preBoIFN-γ转染Sf9细胞,利用间接免疫荧光试验鉴定30株单抗是否与杆状病毒表达载体系统表达的rBac-BoIFN-γ反应,结果显示,1B4、1D2、1E7、2B12、2D8、4D3、5B8、5F5和7D109株单抗未出现明显荧光呈阴性反应；1D5、lG5、1H2、1H5、2B4、2D7、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、3E3、3E9、3F1、3F2、4C8、6C7、6E8、7A6和7E521株单抗在细胞膜上均有明显特异性荧光,与rBac-BoIFN-γ呈阳性反应。收集PWM刺激牛全血的含天然BoIFN-γ的血浆以阻断ELISA (Inhibition ELISA)方法鉴定30株单抗,结果显示,1G5、1H2、1H5、2E2、2E3、2G5、3E3、3E9、4D3、5B8和6C7等11株单抗在该项试验中抑制率在50%以上,最大抑制率依次为75.09%、79.10%、79.55%、71.35%、83.40%、84.76%、83.33%、76.10%、93.26%、74.90%和85.43%,具有与天然BoIFN-γ反应的能力。此外,在以分泌型Flp-In-293-BoIFN-γ-FLAG细胞系表达的rFLAG-BoIFN-γ为阻断剂的阻断ELISA实验中,2G5、3E3和3E9三株单抗抑制率达到90%以上,最大抑制率分别为95.10%、91.64%和94.14%,与该细胞系表达的BoIFN-γ具有良好反应性。终上所述,本研究获得了30株分泌针对原核表达BoIFN-γ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1G5、1H2、1H5、2E2、2E3、2G5、3E3、3E9、4D3、5B8和6C7等11株单抗具有识别天然BoIFN-γ的潜能,展现了这些单抗良好的应用价值,为后续相关研究提供了理想的生物材料；此外2G5、3E3和3E9三株单抗与本实验室现有的各种来源BoIFN-γ均具有良好反应性,包括Flp-In-293-BoIFN-y-FLAG细胞系表达的BoIFN-γ,可为该细胞系的应用提供良好的配体单抗,为其后续研究奠定了基本的物质基础。