研究背景细胞衰老是细胞不断分裂增殖过程中的端粒缩短或接受到刺激之后发生DNA损伤进而发生的细胞死亡。细胞衰老是一种相对稳定的状态,在此过程中DNA损伤会激活p53基因进而影响细胞周期使细胞最后走向死亡。如果癌基因激活或抑癌基因失活,细胞将不发生死亡而是变为永生化细胞,这类细胞无限制增殖聚集最终演变为肿瘤。细胞衰老不止发生在正常体细胞中,肿瘤细胞也可发生细胞衰老,发生衰老的细胞由于细胞周期被阻滞,不再增殖,抑制肿瘤生长,所以细胞衰老也被认为与肿瘤发生发展有关。衰老的细胞会产生多种炎症因子,募集巨噬细胞、NK细胞、中性粒细胞活化,以利于清除衰老细胞,从而诱发一系列的炎症反应。染色体端粒是位于染色体末端的短串联重复DNA序列。端粒是包含双链重复序列TTAGGG的DNA,其中有一个单链的3 ’端粒回环部分,这个端粒回环部分可以阻止端粒末端双螺旋和碱基配对结构。端粒通过自身的缩短保护染色体末端的降解和融合,发挥“帽子”功能。细胞复制过程中端粒重复序列不断丢失、缩短,当端粒缩短至关键长度后,对染色体保护消失,DNA受损加速衰老,细胞死亡。研究发现,细胞中存在一种与端粒合成有关的酶,可以维持甚至加长端粒的长度,称为端粒酶。端粒酶是一种核蛋白(RNP),由RNA重复序列和蛋白质催化亚基(TERT)组成。除干细胞、生殖细胞之外正常人体细胞中端粒酶一般是检测不到的,疾病状态下一些良性病变细胞也测不到端粒酶活性,但在恶性肿瘤细胞具有高活性的端粒酶。因此,端粒酶作为一种肿瘤细胞的特异性标志物,它的活性影响着肿瘤细胞的生物学特性。肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 8-2 型,TIPE2(Tumor necrosis α induced protein 8-like2,TNFAIP8L2),与其同属家族的还有TIPE,TIPE1和TIE3,它们在结构上具有一定的同源序列,具有某些相似的生物学功能。TIPE2是一个选择性表达于免疫器官及炎症组织的免疫负调控因子,具有抑制炎症反应、维持机体免疫稳态的重要作用。以往已有研究发现TIPE2在多种炎症性疾病例如脊髓灰质炎,乙型肝炎中表达下调,同时已有研究证明TIPE2具有肿瘤抑制作用,如在胃癌、肝癌、非小细胞肺癌中表达下调。细胞衰老是细胞生命历程中的终末阶段,而端粒酶作为一个端粒的重要调节单位,对细胞衰老的调控至关重要。TIPE2作为一个新型的抑制炎症反应和肿瘤发生的调节蛋白,TIPE2是否会通过调节端粒酶活性进而影响到细胞衰老的发生,从而调节肿瘤的发生发展?我们比较了 24个月与3个月C57小鼠组织中TIPE2的表达情况,发现TIPE2表达随着小鼠年龄的增长而增强,提示TIPE2可能与细胞衰老有关,基于此我们进一步对TIPE2在细胞衰老过程中的具体作用及作用机制进行了深入研究。研究目的1.探讨TIPE2在细胞衰老中的作用;2.阐明TIPE2调控端粒酶活性参与细胞衰老的分子机制;3.探讨TIPE2调控的细胞衰老在肿瘤发生中的作用及机制。研究方法1.体内实验1.1动物模型SPF级野生型C57(WT)和TIPE2--雄性小鼠分为两组,每组20只,独立饮食饲养,分别在3个月、24个月处死小鼠,留取小鼠新鲜血清,检测比较C57和TIPE2-/-小鼠血清中的白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(ASTL)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆固醇(CHO)等的差异。取C57小鼠的肝、肾、脾等新鲜组织,一份冻存于-80℃,待冰冻切片后通过IHC方法检测TIPE2表达差别,一份新鲜组织提取蛋白质,以Western blot方法检测不同年龄C57小鼠的TIPE2表达。1.2动物模型中TIPE2的表达检测上述C57小鼠新鲜脾组织切小块,研磨棒研磨提取蛋白,用TIPE2(JinSiTe,1:500)、β-actin(proteinteck,1:1000)为一抗,用 Western blot 的方法测检测蛋白表达。肝组织冰冻切片,以TIPE2(JinSiTe,1:200)为一抗,做IHC,DAB显色观察TIPE2表达区别。2.体外实验研究TIPE2在细胞衰老中的作用2.1细胞培养结肠癌细胞系HT-29、原代培养的小鼠肺呼吸道平滑肌细胞ASMC和人胚肾上皮细胞系293T均培养在含有10%胎牛血清RIPA 1640培养基中,结肠癌细胞系SW480培养于含10%胎牛血清的F100中,细胞放置在37℃、5%C02湿润的细胞培养箱中进行培养。2.2 TIPE2表达水平与细胞衰老用Western blot的方法检测TIPE2在不同代数的原代培养ASMC细胞(7代,14代)中的表达差异。以pRK5-TIPE2表达质粒及空载质粒对照转染ASMC或HT29细胞,同时在转染的HT29细胞中给予加速细胞衰老的刺激H202,用SA-β-gal染色检测细胞衰老指标β-半乳糖苷酶,比较分析TIPE2表达水平与细胞衰老之间的关系。2.3 TIPE2过表达对细胞增殖及细胞周期的影响TIPE2表达质粒转染HT-29和ASMC细胞,用Western blot的方法检测过表达TIPE2后Caspase-3活性与P21蛋白的表达变化,CCK-8的方法检测细胞增殖情况,用流式细胞术检测TIPE2过表达后细胞凋亡及细胞周期的变化。3.TIPE2对细胞端粒酶的调控作用及机制3.1 TIPE2过表达对hTERT表达以及活性的影响TIPE2表达质粒转染结肠癌细胞系HT-29、SW480,一定时间后通过Western blot的方法检测TIPE2过表达对hTERT的蛋白水平的影响,用端粒酶TERT活性检测试剂盒检测TIPE2过表达后端粒酶hTERT的活性,分析TIPE2表达水平与hTERT活性之间的关系。3.2 TIPE2调控hTERT的分子机制的研究TIPE2表达质粒转染HT-29细胞,Western blot的方法检测过表达TIPE2后细胞的TGF-β、c-myc的表达水平及细胞信号通路p-Smad3、Smad3、Erk的活化情况,同时用核质分离的方法检测细胞核、细胞质内与端粒酶调控有关的转录因子c-myc以及c-Ets-2的表达水平与分布情况。Co-IP的方法检测TIPE2与转录因子c-myc、c-Ets-2结合情况。3.4 TIPE2入核作用免疫荧光的方法检测TIPE2进入细胞核的情况,TIPE2与pRK5转染HT-29,用TIPE2抗体结合细胞内TIPE2,然后用荧光二抗检测TIPE2在细胞内的定位情况。TIPE2-flag表达质粒和截短型TIPE2突变体R24-flag质粒转染ASMC细胞后,用Flag抗体作为一抗,用荧光二抗检测外源性TIPE2在细胞内的分布情况。进一步向ASMC细胞中分别转染flag-TIPE2质粒过表达或截短型TIPE2质粒后,用2 ng/ml TGF-β刺激细胞,应用激光共聚焦显微镜检测细胞外源性TIPE2进入细胞核的以及TGF-β对TIPE2进入细胞核的影响。研究结果1.TIPE2在组织内的表达水平随小鼠年龄增长而增强Western blot方法检测到TIPE2在24个月C57小鼠脾组织中的表达水平明显高于3月小鼠,IHC检测亦发现24月C57小鼠组织中TIPE2染色较强,提示TIPE2随小鼠年龄增长呈现高表达趋势。检测3个月、24个月TIPE2-/-与C57小鼠的血清指标,24个月TIPE2-/-小鼠肝功能指标如碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(ASTL)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆固醇(CHO)等的血清学水平明显高于3个月TIPE2-/-小鼠,但较同龄的野生型小鼠明显降低。24个月TIPE2-/-小鼠白蛋白(ALB)水平低于3个月小鼠,但明显高于同龄C57小鼠。这些结果说明TIPE2随小鼠年龄增长表达增高的同时肝功能明显下降,提示TIPE2在小鼠体内可能具有一定的促衰老作用。2.TIPE2具有促进体外培养细胞衰老死亡的作用2.1 TIPE2表达水平增高可以加速细胞衰老TIPE2在高传代(14代)原代培养ASMC细胞的表达水平明显低于低代细胞(7代),β-半乳糖苷酶阳性细胞在TIPE2过表达的细胞内明显多于对照细胞,给予H2O2刺激后发现H2O2在加速细胞衰老(β-半乳糖苷酶阳性细胞增多)的同时显著上调TIPE2的蛋白表达水平。这些结果都提示TIPE2高表达可以加速细胞衰老。2.2 TIPE2具有促进细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用HT29细胞和ASMC细胞中过表达TIPE2之后检测细胞周期发现细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长明显被抑制,Caspase3活性增强。在HT-29细胞中过表达TIPE2过表达质粒,AnnexinV/PI检测结果显示TIPE2过表达的细胞凋亡明显增多,发现细胞周期蛋白P21表达明显升高,同时p-1κB通路活化被抑制,这些结果均提示TIPE2显著抑制细胞增殖、促进细胞死亡。3.TIPE2通过调控hTERT活性促进细胞衰老3.1 TIPE2具有抑制hTERT活性的作用在结肠癌细胞系HT-29,和SW480中过表达TIPE2后发现,hTERT蛋白水平明显下降,同时端粒酶活性亦明显降低,表明TIPE2能够抑制hTERT活性。3.2 TIPE2具有通过Erk/c-myc通路调控hTERT的作用Smad、c-myc、c-Ets-2是端粒酶hTERT启动子调控区重要的顺式作用元件,因而TIPE2转染细胞HT-29后,利用Western blot检测c-myc表达情况,结果发现核转录因子c-mmyc的表达在TIPE2过表达后较对照细胞明显下降,核质分离实验发现TIPE2过表达后细胞核中的c-myc蛋白水平亦显著下降,提示TIPE2不仅降低c-myc表达,而且可以抑制c-myc进入细胞核。另外,TIPE2转染细胞的Erk磷酸化水平显著降低,给予Erk磷酸化抑制剂可以完全抑制住TIPE2对c-myc的影响,但不能够完全抑制TIPE2对hTERT的影响,提示TIPE2除了降低c-myc表达抑制端粒酶活性外尚可能存在其它调控方式。3.3 TIPE2具有通过结合c-Ets-2抑制hTERT的作用在HT-29细胞系中TIPE2过表达后细胞c-myc的核转录因子c-Ets-2蛋白水平较对照细胞明显下降,但是核质分离实验发现TIPE2过表达细胞内c-Ets-2蛋白仅在细胞核中减少,在细胞质中反而增多,提示TIPE2可能阻滞c-Ets-2的入核。进一步Co-IP实验发现TIPE2可以与c-Ets-2结合,证实TIPE2在细胞质内结合c-Ets-2后抑制其入核,最终抑制hTERT的转录。3.4 TIPE2具有通过TGF-β/Smad3通路调控hTERT的作用HT-29细胞转染TIPE2,Western blot检测发现TGF-β蛋白水平明显高于对照细胞,p-Smad3水平亦显著高于对照细胞,说明TIPE2过表达能够显著上调TGF-β,激活Smad3通路。TGF-β是Smad信号通路的重要调节因子,由于TIPE2可以激活Smad信号通路,因而我们进一步研究了 TGF-β是否能够影响TIPE2。细胞HT-29转染TIPE2表达质粒,免疫荧光检测发现TIPE2进入细胞核,TGF-β作用于细胞不仅能够显著增加TIPE2蛋白水平,而且促进TIPE2进入细胞核。而截短型TIPE2并不影响TIPE2进入细胞核。结论1.TIPE2通过抑制hTERT的表达及活性促进细胞衰老;2.TIPE2主要在基因水平上调控hTERT转录。TIPE2下调转录子c-myc、c-Ets-2表达,减少c-myc、c-Ets-2结合hTERT启动子区域,进而抑制hTERT转录;3.TIPE2对端粒酶相关转录因子的调控与Smad、Erk信号通路有关;4.TIPE2可以通过抑制肿瘤细胞的端粒酶活性抑制肿瘤细胞的生长,发挥抗瘤作用。创新点及意义1.首次阐述了免疫负调节分子TIPE2在细胞衰老过程中的作用及分子机制,丰富了 TIPE2的功能。2.研究发现TIPE2主要通过调控端粒酶hTERT的基因转录进而抑制端粒酶hTERT的活性。3.以调节细胞衰老为切入点提出TIPE2抑制端粒酶活性抗肿瘤的新思路。