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目的：
目前，肺癌已成为全球最常见的癌症，同时也是最主要的癌症致死疾病。在肺癌中，非小细胞肺癌(NSCLC)的占比达到了80-85%。微小非编码RNA（miRNA）是一类长为~22nts的非编码RNA，其通过靶向特定的mRNA在肿瘤的发生发展中发挥着关键作用。我们最近的研究已经探讨miR-196b通过靶向GATA6和TSPAN12基因促进NSCLC增殖的机理，且miR-196b在NSCLC组织中的表达显著高于正常癌旁组织。为了进一步探讨miR-196b在NSCLC中的作用，我们通过不同的miRNA靶点预测网站预测了一批miR-196b的靶基因，并结合TCGA数据集分析以及RT-PCR试验，最终确认FAS为miR-196b的候选靶基因。FAS是著名的细胞死亡受体，最先在免疫细胞中被发现，近年的报道发现FAS在癌症的发生发展中也有着重要作用。本文意在探讨miR-196b通过调控FAS表达影响NSCLC的增殖的机制。
方法：
1.miR-196b在NSCLC中的表型研究及其与FAS的相关性研究
利用TCGA数据分析，RT-PCR分析，克隆形成试验（结晶紫染色），MTT细胞活性检测方法确认miR-196b在NSCLC细胞中的功能。通过Targetscan、RNA22、miRDB、miRanda、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR5七个miRNA靶点预测网站预测了一批miR-196b靶基因，然后用TCGA数据集验证miR-196b与靶基因的表达相关性，然后通过RT-PCR试验确认FAS为miR-196b的候选靶基因，最终通过Western Blotting试验进一步确认miR-196b对FAS蛋白的调控作用。
2.FAS在NSCLC中的表型研究
通过TCGA数据库分析、Kaplan-Meier生存分析以及对临床组织的RT-PCR分析和IHC分析初步确认FAS在NSCLC中的作用。然后通过MTT细胞活性检测，结晶紫染色，Western Blotting方法，FACS技术确认FAS是否对NSCLC细胞的增殖、克隆形成及细胞周期有影响。
3.FAS在NSCLC中对JAK2/STAT3信号通路的影响
通过Western Blotting方法确认FAS对JAK2/STAT3信号通路的影响。
4.FAS对NSCLC中IL-6的表达及分泌的影响
分别通过RT-PCR、ELISA分析确认转染siFAS的细胞中IL-6的表达及分泌是否受到影响。取培养过FAS基因沉默的NSCLC细胞的培养基上清用于不做任何处理的NSCLC细胞的培养，48h后，利用MTT细胞活性分析和Western Blotting方法确认来源于FAS基因沉默的NSCLC细胞的条件培养基是否会影响NSCLC细胞的增殖及STAT3的磷酸化水平。
5.FAS对NSCLC中NF-κB（p65）入核的影响以及p65对于NSCLC的影响
利用核质蛋白提取试剂盒将NSCLC细胞的核内蛋白和胞浆蛋白进行分离，并通过Western Blotting方法确认FAS基因沉默对p65入核的影响。然后，分别通过结晶紫染色、RT-PCR和ELISA确认p65对细胞克隆形成、IL-6表达及分泌的影响。接着，取培养过P65高表达的NSCLC细胞的培养基上清用于不做任何处理的NSCLC细胞的培养，48h后，利用MTT细胞活性分析和Western Blotting方法确认来源于P65高表达的NSCLC细胞的条件培养基对NSCLC细胞的增殖及STAT3的磷酸化水平的影响。最后，通过TCGA数据分析进一步确认STAT3、IL-6、P65两两之间的相关性。
6.miR-196b对NSCLC中p65/IL-6/STAT3信号通路的影响。
利用核质蛋白提取试剂盒将NSCLC细胞的核内蛋白和胞浆蛋白进行分离，并通过Western Blotting方法确认miR-196b对p65入核的影响。然后，分别通过RT-PCR和ELISA确认miR-196b对IL-6表达及分泌的影响。通过Western Blotting方法确认miR-196b对STAT3的磷酸化水平的影响。
结果：
上调的miR-196b可以促进NSCLC细胞的的增殖并且可以抑制NSCLC中FAS的表达。
FAS在NSCLC组织中的表达水平普遍较低，而且低水平的FAS表达与NSCLC的不良预后相关。此外，FAS的沉默能够促进NSCLC细胞的增殖、克隆形成和细胞周期。
FAS的沉默能够促进NSCLC细胞中JAK2/STAT3信号通路的激活，并且低水平的STAT3能够逆转FAS沉默后对细胞增殖影响。
FAS的沉默能够促进NSCLC细胞中IL-6的表达，并促进IL-6的分泌。
FAS的沉默能够促进NSCLC细胞中P65蛋白的核内转运。另外，P65的高表达同样能够促进IL-6的表达、STAT3的磷酸化水平和NSCLC细胞的增殖。TCGA数据表明STAT3、IL-6、P65两两直接都存在正相关关系。
miR-196b能够激活p65/IL-6/STAT3信号通路从而促进NSCLC的增殖。
结论：
miR-196b通过FAS介导的IL-6/JAK2/STAT3信号通路激活促进NSCLC的细胞周期及增殖能力。
靶向miR-196b/FAS/NF-κB/IL6/JAK2/STAT3通路是一个有潜力的NSCLC治疗策略。
目前，肺癌已成为全球最常见的癌症，同时也是最主要的癌症致死疾病。在肺癌中，非小细胞肺癌(NSCLC)的占比达到了80-85%。微小非编码RNA（miRNA）是一类长为~22nts的非编码RNA，其通过靶向特定的mRNA在肿瘤的发生发展中发挥着关键作用。我们最近的研究已经探讨miR-196b通过靶向GATA6和TSPAN12基因促进NSCLC增殖的机理，且miR-196b在NSCLC组织中的表达显著高于正常癌旁组织。为了进一步探讨miR-196b在NSCLC中的作用，我们通过不同的miRNA靶点预测网站预测了一批miR-196b的靶基因，并结合TCGA数据集分析以及RT-PCR试验，最终确认FAS为miR-196b的候选靶基因。FAS是著名的细胞死亡受体，最先在免疫细胞中被发现，近年的报道发现FAS在癌症的发生发展中也有着重要作用。本文意在探讨miR-196b通过调控FAS表达影响NSCLC的增殖的机制。
方法：
1.miR-196b在NSCLC中的表型研究及其与FAS的相关性研究
利用TCGA数据分析，RT-PCR分析，克隆形成试验（结晶紫染色），MTT细胞活性检测方法确认miR-196b在NSCLC细胞中的功能。通过Targetscan、RNA22、miRDB、miRanda、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR5七个miRNA靶点预测网站预测了一批miR-196b靶基因，然后用TCGA数据集验证miR-196b与靶基因的表达相关性，然后通过RT-PCR试验确认FAS为miR-196b的候选靶基因，最终通过Western Blotting试验进一步确认miR-196b对FAS蛋白的调控作用。
2.FAS在NSCLC中的表型研究
通过TCGA数据库分析、Kaplan-Meier生存分析以及对临床组织的RT-PCR分析和IHC分析初步确认FAS在NSCLC中的作用。然后通过MTT细胞活性检测，结晶紫染色，Western Blotting方法，FACS技术确认FAS是否对NSCLC细胞的增殖、克隆形成及细胞周期有影响。
3.FAS在NSCLC中对JAK2/STAT3信号通路的影响
通过Western Blotting方法确认FAS对JAK2/STAT3信号通路的影响。
4.FAS对NSCLC中IL-6的表达及分泌的影响
分别通过RT-PCR、ELISA分析确认转染siFAS的细胞中IL-6的表达及分泌是否受到影响。取培养过FAS基因沉默的NSCLC细胞的培养基上清用于不做任何处理的NSCLC细胞的培养，48h后，利用MTT细胞活性分析和Western Blotting方法确认来源于FAS基因沉默的NSCLC细胞的条件培养基是否会影响NSCLC细胞的增殖及STAT3的磷酸化水平。
5.FAS对NSCLC中NF-κB（p65）入核的影响以及p65对于NSCLC的影响
利用核质蛋白提取试剂盒将NSCLC细胞的核内蛋白和胞浆蛋白进行分离，并通过Western Blotting方法确认FAS基因沉默对p65入核的影响。然后，分别通过结晶紫染色、RT-PCR和ELISA确认p65对细胞克隆形成、IL-6表达及分泌的影响。接着，取培养过P65高表达的NSCLC细胞的培养基上清用于不做任何处理的NSCLC细胞的培养，48h后，利用MTT细胞活性分析和Western Blotting方法确认来源于P65高表达的NSCLC细胞的条件培养基对NSCLC细胞的增殖及STAT3的磷酸化水平的影响。最后，通过TCGA数据分析进一步确认STAT3、IL-6、P65两两之间的相关性。
6.miR-196b对NSCLC中p65/IL-6/STAT3信号通路的影响。
利用核质蛋白提取试剂盒将NSCLC细胞的核内蛋白和胞浆蛋白进行分离，并通过Western Blotting方法确认miR-196b对p65入核的影响。然后，分别通过RT-PCR和ELISA确认miR-196b对IL-6表达及分泌的影响。通过Western Blotting方法确认miR-196b对STAT3的磷酸化水平的影响。
结果：
上调的miR-196b可以促进NSCLC细胞的的增殖并且可以抑制NSCLC中FAS的表达。
FAS在NSCLC组织中的表达水平普遍较低，而且低水平的FAS表达与NSCLC的不良预后相关。此外，FAS的沉默能够促进NSCLC细胞的增殖、克隆形成和细胞周期。
FAS的沉默能够促进NSCLC细胞中JAK2/STAT3信号通路的激活，并且低水平的STAT3能够逆转FAS沉默后对细胞增殖影响。
FAS的沉默能够促进NSCLC细胞中IL-6的表达，并促进IL-6的分泌。
FAS的沉默能够促进NSCLC细胞中P65蛋白的核内转运。另外，P65的高表达同样能够促进IL-6的表达、STAT3的磷酸化水平和NSCLC细胞的增殖。TCGA数据表明STAT3、IL-6、P65两两直接都存在正相关关系。
miR-196b能够激活p65/IL-6/STAT3信号通路从而促进NSCLC的增殖。
结论：
miR-196b通过FAS介导的IL-6/JAK2/STAT3信号通路激活促进NSCLC的细胞周期及增殖能力。
靶向miR-196b/FAS/NF-κB/IL6/JAK2/STAT3通路是一个有潜力的NSCLC治疗策略。