最近研究表明,白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）在癌基因诱导衰老方面起关键作用（oncogene-induced-senescense,OIS）。旁分泌的IL-6可以诱导初始细胞增殖,自分泌的IL-6可导致细胞衰老，限制细胞恶性转化和侵袭性增长,在垂体腺瘤发生与发展中起至关重要的作用。IL-6参与垂体腺瘤的衰老与增殖。我们的研究旨在比较参与过早熟衰老途径中正常、老化、垂体腺瘤细胞中相关蛋白和细胞因子的表达。掌握垂体腺瘤的衰老调控，合理应用细胞衰老阻止静默生长肿瘤增殖和恶变。第一部分构建F344大鼠亚急性泌乳素腺瘤衰老模型并评估其研究有效性目的：构建泌乳素腺瘤亚急性衰老模型，评估此法构建的亚急性垂体瘤模型对衰老研究的可行性及有效性。方法：15只Fischer344雌性大鼠被随机分为三组,每组5只。分为A:正常对照组；B:雌激素诱导的垂体腺瘤组；C：D-半乳糖诱导亚急性衰老垂体腺瘤组。诱导垂体衰老使用连续D-galactose（D-gal）腹腔注射，泌乳素腺瘤生成是通过含有雌激素（DES）缓释硅胶管植入。正常对照组:生理盐水硅胶管皮下埋植，术后7d腹腔内注射生理盐水；B组垂体腺瘤：10mgE2缓释管皮下埋置+术后7d腹腔内注射生理盐水；C组亚急性衰老垂体腺瘤组：10mgE2+建模7d后腹腔内注射D-半乳糖，200mg/kg/d。对照组注射等量的生理盐水。连续注射到术后8w处死所有的大鼠。实验动物伦理的标准参照NIH实验动物指南，动物实验被苏州大学伦理委员会批准,观察垂体形状、大小、质地和颜色，与视神经及颈内动脉比邻关系，观察鞍底形状，是否增大，骨质是否破坏。Y迷宫测试大鼠的学习和记忆能力的变化。观察大鼠的、体型、体重、皮毛、精神状态、尿量和对外界刺激的反应能力，综合评估模型的有效性。垂体和大鼠体重进行记录和分析。对垂体组织用PRL antibody进行免疫组化染色，β-Galactosidase酶活性试剂盒检测衰老相关β-半乳糖苷酶染色。结果：（1）D-半乳糖诱导亚急性衰老垂体腺瘤组大鼠体重增加缓慢，尿量增加、尿比重下降。反应能力和学习与记忆能力下降，出现衰老特征；（2）与对照组相比,接受DES诱导的B、C组垂体重量增加5倍，（p <0.01），B组垂体瘤最重。解剖显示肿瘤压迫视神经、颈内动脉，造成鞍底扩大，骨质变薄，表明肿瘤具有侵袭性。HE染色B，C组既有肿瘤生长特点又有衰老特征。垂体细胞核大小不一，深染，有异型性。呈肿瘤样改变。肿瘤血管增生呈片状，也称作血管湖样区域。C组有空泡样细胞产生，细胞膜皱缩，同B组相比，肿瘤细胞相对较小，变形，部分可见脂褐素样颗粒。对照组垂体免疫组织化学表达PRL阳性细胞比例不到5%，B组视野下超过90%的细胞质中PRL呈强阳性，C组70%细胞呈强阳性表达；（3） B组PRL分泌显著增加，C组中泌乳素水平明显降低；（4）冰冻切片和免疫组织化染色显示β-Galactosidase酶染色阳性颗粒在C组显著增加,在B组极低，A组基本无表达。结论:雌激素联合D-半乳糖能够成功诱导F344大鼠产生亚急性PRL腺瘤。动物模型经检测，在成功生成泌乳素腺瘤的同时也出现明显的垂体瘤细胞衰老特征。第二部分垂体瘤转化基因（PTTG）同衰老相关蛋白在垂体衰老和垂体瘤进展中关联性研究目的：阐明癌基因诱导衰老在垂体瘤发生过程中的作用。方法：18只雌性大鼠随机分为3组，每组6只大鼠。正常对照组（control），D-半乳糖诱导衰老组（aging）；E2垂体腺瘤组（tumor）。造模方法同前。观察大鼠的一般生命体征和衰老表型。对垂体进行HE及免疫组化染色。Real-time PCR测量垂体内PTTG、p53、p21、p16mRNA表达,观察蛋白表达相互关系。Western-blot检测p16、p21、PTTG在垂体组织中表达。结果：（1）aging组大鼠出现明显衰老的征,包括脱毛,体重下降,尿量减少，Tumor组大鼠尿量明显增加，aging组大鼠4周后体重减轻。衰老组垂体明显小于正常对照组垂体，垂体萎缩，质地韧，似空蝶鞍表现。垂体腺瘤组垂体重量超出正常组3倍，P <0.01，有显著差异。衰老组大鼠的体重略小于正常组大鼠，没有明显的差异。衰老组大鼠垂体重量比肿瘤组大鼠小，P <0.01有统计学意义；（2）衰老组大鼠垂体病理切片可见垂体腺管状结构，细胞的数量明显减少，没有明显的血管增生。胞质内有空泡，异染色质存在于细胞中。在衰老组大鼠垂体中，PRL免疫组化阴性，垂体腺瘤组为强阳性；（3）肿瘤组大鼠垂体组织中PTTG mRNA表达水平明显高于对照组和衰老组。衰老组中PTTG mRNA表达水平明显下降,为三组最低，组间有显著差异，P <0.05。衰老组p53、p16、p21基因表达明显高于对照组和肿瘤组，三者表达在肿瘤组明显降低；（4）采用Western-blot半定量分析显示目的基因的蛋白表达水平。垂体瘤组内PTTG表达明显增加。p16、p21在衰老组为高表达，在垂体腺瘤组表达减弱。结论：1. p16、p21是垂体细胞衰老重要的调控因子2. PTTG表达减弱导致垂体细胞非整倍体形成、DNA损伤，进而激活衰老通路。PTTG基因过表达引起绕过OIS，导致肿瘤形成。3.雌激素能增加PTTG表达，产生PRL腺瘤，垂体细胞衰老导致PTTG水平下降。抑制PTTG表达以及雌激素结合受体转录，可以诱导衰老的信号通路激活。第三部分IL-6在垂体瘤细胞衰老中表达调控和作用机制研究目的：研究旨在比较参与过早熟衰老途径中，正常、老化、垂体腺瘤细胞中相关蛋白和细胞因子的表达。能够很好的掌握垂体腺瘤的衰老调控，合理应用阻止静默生长肿瘤增殖和恶变。方法:27只F344雌性大鼠被分成5组，对照组3只，其余各组6只。对照组（A）；垂体衰老组（B）；垂体肿瘤组（C）；垂体瘤+早期衰老组（D）；垂体肿瘤+中期诱导衰老组（E）。衰老组8周内每日D-半乳糖20mg/kg/d，术后腹腔内注射，早期衰老干预组垂体肿瘤衰老组注射49天，术后七天内开始，而中期衰老干预组注射42d，术后7d内开始。所有大鼠8周后断头处死。其余组注射生理盐水比较，处死前内眦静脉采血。鼠白介素-6酶联免疫试剂盒（CUSABIO）检测血浆IL-6水平。观察大鼠的一般生命体征和衰老表型。垂体组织行HE染色和PRL免疫组化染色。提取垂体RNA，Real-time PCR检测垂体内PTTG、p53、p21、p16、IL-6、C/EBPβ mRNA表达，Western-blot检测p16、p21、IL-6在垂体组织中表达。结果：中期诱导衰老组尿量显著增加，相对于其它组（P <0.01）；（2）单纯衰老组大鼠垂体重量最轻，早期衰老组的垂体重量次之，单纯肿瘤组垂体重量最大；（3）衰老组细胞数量明显减少，细胞间隙扩大，血管稀疏，无明显的血管增生，高倍镜下可见胞浆中可见核浓缩和脂褐素出现。垂体腺瘤和中期诱导衰老组，90%以上的细胞显示PRL强阳性，早期衰老超过70%的细胞表现为阳性。正常对照组、衰老组PRL阳性细胞比例少于5%；（4）衰老组大鼠血清IL-6明显低于对照组。肿瘤组血清IL-6含量与衰老组差异明显。早期衰老组及中期衰老组IL-6浓度明显低于对照组；（5）衰老组p53、p16、p21、IL-6、C/EBPβ基因垂体中表达明显高于对照组和衰老肿瘤组，但是，在肿瘤组表达最低。衰老组的IL-6表达最高，在中期诱导衰老组几乎无表达。早期衰老组高于单纯肿瘤组和中期衰老组。p21和p16表达与IL-6几乎相同。PTTG表达趋势同IL-6相反。Western-blot结果表明，IL-6在肿瘤组织和正常垂体组织表达水平极低，在衰老肿瘤内也较低。P16，p21衰老组中表达增加、在肿瘤组表达降低。结论：1.细胞内在的IL-6通过癌基因诱导衰老参与垂体瘤的发生，被细胞内PTTG异常表达诱导衰老产生。绕过衰老肿瘤形成。2. C/EBPβ是白介素介导衰老途径中一个重要的调节因子。其调控垂体腺瘤的形成。雌激素高表达导致IL-6及其转录因子C/EBPβ表达降低。IL-6-C/EBPβ通路的衰老体系难以维持。提高泌乳素腺瘤中IL-6水平会产生衰老，抑制肿瘤增殖。3..IL-6-C/EBPβ通路与p16INK4A-Rb，ARF-p53通路在垂体细胞共同调控垂体细胞衰老。