水貂阿留申病(Aleutian Disease, AD)的病原是水貂阿留申病毒(Aleutian Disease Virus, ADV),在1956年首次发现于美国某农场中,因阿留申基因型毛色的水貂而得名。至今已证明所有基因型的水貂都是该病的易感动物,但不同基因型水貂的发病率和严重程度不同。该病在世界各地都有发生已成为目前对圈养水貂威胁最大的传染病之一。该病目前有多种诊断方法,包括病原分离,病毒DNA扩增(PCR),碘凝集试验(IAT),酶联免疫吸附实验(ELISA)等,但由于技术和实验条件的限制,多年来在世界范围内应用最广的方法是对流免疫电泳法(CIEP),该法操作简便,对实验条件要求不高,有较高的特异性,但随着技术的进步和检测标准的提高,该法结果判定的误差较大,易散毒,耗时较长的缺点已不能适应我国水貂养殖业发展的要求,亟需更加安全,高效的方法来代替。胶体金免疫层析技术(GICA)是以硝酸纤维素膜为固相载体,通过毛细管作用原理,以胶体金为标记物来显示结果的一种新型的检测技术。该种方法具有操作简便、快捷,结果清楚、易于判断、误差小,不需要任何仪器、成本低廉,对操作人员技术要求不高等优点,非常适用于现场及自动化检测。因此,该技术在体外快速检测领域得到了迅猛发展,目前在兽医学领域的应用也越来越多。本研究针对目前水貂阿留申病检测方法中存在的问题,应用胶体金免疫层析技术(GICA),采用间接法的原理,初步建立了水貂阿留申病胶体金免疫层析诊断方法。主要有以下几个方面的研究。(1)针对VP2基因上主要抗原区的两个片段设计合成两对特异性引物,将两片段分别克隆入原核表达载体pET-28a(+)和pMAL-p2X的多克隆位点中,将重组质粒转化入宿主菌BL21中,采集样品通过SDS-PAGE、Western-blot鉴定,两蛋白都能与ADV抗体发生特异性反应。(2)用柠檬酸三钠还原法,水浴法烧制直径为25nm的胶体金颗粒。制备胶体金标记兔抗貂IgG,确定兔抗貂IgG最佳标记浓度为12μg/mL,最适标记pH值为9.1,以VP2A蛋白作为检测线标记物,最适划线浓度为1mg/mL,以羊抗兔IgG作为对照线标记物,最适划线浓度为0.8mg/mL。(3)根据最适标记条件组装试纸条进行敏感性,特异性的评价,并与对流免疫电法比较,结果显示免疫层析法敏感性是对流免疫电泳法的2倍,与非ADV阳性血清不发生反应,特异性较好。