白及优质种苗繁育技术及其促生内生菌的筛选和鉴定

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白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.是我国传统名贵中药材之一,为兰科白及属多年生草本植物,以干燥块茎入药。近年来,白及在临床上的应用范围不断扩大,需求量急剧增加,价格也急剧攀升。采用组织培养技术,能快速繁育出大量优质种苗,明显缩短育苗周期,是解决白及种苗短缺较为有效的方法。药用植物内生菌多样性的研究已成为当今研究的热点,分离药用植物的内生菌不仅有利于充开发利用内生菌资源,同时也是获取具有重要研究价值菌株的新途径。为此,本文采用植物组织培养技术,优化了白及种子萌发和假鳞茎增殖膨大的最佳培养基,摸索了白及组培苗移栽的最佳假鳞茎粒径长,并对白及内生菌进行了分离和鉴定,获得了1株促生效果最好的内生细菌B.velezensis F。获得的主要结果如下:1.以浙江宁波基地白及成熟未开裂的蒴果为材料,经优化得到促进白及种子萌发的最佳培养基是MN+100 mg/L KH2PO4+8 g/L琼脂+100 g/L香蕉泥+30 g/L蔗糖。以上述种子无菌萌发后获得的实生苗为材料,筛选出促进白及假鳞茎膨大的最佳培养基是1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+100 g/L土豆+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+2 g/L花宝5号;筛选出促进白及假鳞茎增殖的最佳培养基为1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+100 g/L土豆+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+3 g/L花宝5号。不同假鳞茎粒径的白及移栽试验表明,假鳞茎粒径达到6 mm时,即可进行移栽,不仅节约生产成本,成活率也高达98.44%。2.从白及组培瓶苗的健康根、茎、叶、假鳞茎中共分离到7株内生细菌,通油菜和水稻种子萌发实验,筛选出1株促生效果最好的内生菌F。通过形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析,最终鉴定菌株F为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis,该菌株已经保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号:CCTCC NO:M 2019838)。3.用B.velezensis F的发酵液对白及移栽苗进行浇灌,发现发酵液对白及的生长有促进作用,且发酵液OD600=0.5时,促生效果最好,假鳞茎平均诱导率达127%,假鳞茎平均粒径达7.592 mm。4.利用液相色谱-质谱联用(LC-MS)对B.velezensis F的发酵液中的激素进行分析,发现B.velezensis F能产生KT、SA和6-BA等激素,含量分别为20.87ng/L、56.91μg/L和30.40 ng/L。
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