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背景：
肿瘤多药耐药（Multi-drug resistance，MDR）是癌细胞对多种化疗药物的一种获得性耐药，是临床上癌症患者治疗成功的主要障碍。虽然治疗肿瘤的研究不断进步，治疗方法日益完善，但是还是有超过50%的肿瘤对化疗药物产生快速耐药性，从而导致患者预后效果不佳[1]。肿瘤MDR的机制十分复杂，往往是由多种基因、多种因素和多种途径共同作用诱导的结果。肿瘤MDR不仅与P糖蛋白（P-gp）介导的经典耐药机制有关，还与凋亡相关基因（Bcl-2、P53、Survivin）、细胞增殖以及相关逆转肿瘤多药耐药的信号通路（NF-κB、State3、Wnt/β-catenin）等非经典耐药机制密切相关。因此，更好地理解药物的耐药机制是开发高效、低毒的新型MDR调节剂（又称化学增敏剂和MDR逆转剂）的关键所在。
姜黄素（Curcumin, Cur）是植物姜黄（Curcuma longa L.）中发挥药理作用的主要活性成分，具有抗炎、抗血管生成、抗氧化以及抗肿瘤等药理作用。近年来，研究显示姜黄素对多种肿瘤的MDR有逆转作用，但对其逆转耐药的研究多集中在P-gp依赖的经典耐药途径。多药耐药的机制非常复杂，往往涉及多条通路、多种基因的共同作用，为了更加深入了解姜黄素逆转多药耐药的机制，本研究目的是通过姜黄素和5-Fu单独以及联合作用于人肝癌耐药细胞株 BEL-7402/5-Fu，检测姜黄素的逆转耐药作用，并且除了从经典的P-gp耐药途径外，还从影响细胞增殖、促进细胞凋亡以及抑制 Wnt/β-cate nin信号通路等途径进一步探讨姜黄素逆转肝癌多药耐药的其他可能机制。
方法：
1.以人肝癌敏感细胞株BEL-7402以及人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-Fu为实验的对象，采用MTT法进行肝癌多药耐药性检测，检测作用前后 BEL-7402细胞和BEL-7402/5-Fu细胞对5-Fu、ADR以及MTX等三种抗肿瘤药物的化疗敏感性，计算这两种细胞对5-Fu、ADR以及 MTX等三种抗肿瘤药物的半数抑制浓度（IC50）和耐药指数（IR）；
2.采用MTT法检测姜黄素对BEL-7402细胞和BEL-7402/5-Fu细胞的内在毒性，绘制细胞增殖抑制曲线，筛选出姜黄素的无毒剂量，并作为逆转耐药的剂量；
3.采用无毒剂量的姜黄素与耐药逆转剂维拉帕米（VRP）和5-Fu单独以及联合作用于BEL-7402/5-Fu细胞，计算细胞抑制率，逆转倍数以及逆转效率；
4.采用无毒剂量的姜黄素与ADR单独以及联合作用于BEL-7402/5-Fu细胞，MTT法测定姜黄素对ADR化疗作用的影响，并计算细胞抑制率；
5.采用流式细胞术检测姜黄素和VRP作用前后对BEL-7402/5-F u细胞内ADR的蓄积的影响；
6.采用实时荧光定量qPCR以及Western blot蛋白印迹法检测BEL-7402细胞以及BEL-7402/5-Fu细胞内P-gp和LRP mRNA以及蛋白的表达；
7.采用实时荧光定量qPCR以及Western b lot蛋白印迹法检测经姜黄素与5-Fu单独以及联合作用后BEL-7402/5-Fu细胞内P-gp和LRP mRNA以及蛋白的表达；
8.采用 Western blot蛋白印迹法检测姜黄素和5-Fu单独或者联合作用前后BEL-7402/5-Fu细胞内CyclinD1、CyclinD2、Cox-2、Bcl-2、Bax、Wnt3a以及β-catenin的表达；
9.使用流式细胞术检测姜黄素和5-Fu单独以及联合作用对细胞凋亡的影响，并计算各组的细胞凋亡率。
结果：
1. MTT检测结果显示，5-Fu、ADR以及MTX等三种抗肿瘤药物对BEL-7402细胞很表现出很高的敏感性，对BEL-7402/5-Fu细胞则表现出较低的敏感性。而且与 BEL-7402细胞相比，BEL-7402/5-Fu细胞对这三种抗肿瘤药物表现出不同程度的耐药性，其耐药指数分别为735.61，2.02，2.09；
2. MTT检测结果发现姜黄素可抑制BEL-7402细胞和BEL-7402/5-Fu细胞的增殖，且随着姜黄素浓度的增加，细胞增殖抑制作用逐渐增强，且呈浓度依赖性。并筛选出姜黄素的无毒剂量，即5μg/mL和10μg/mL；
3.5μg/mL和10μg/mL的姜黄素分别与5-Fu联合作用后，其对BEL-7402/5-Fu细胞增殖抑制作用较单个用药时明显增强，且随着姜黄素浓度的增加，细胞增殖抑制作用逐渐增强。5μg/mL和10μg/mL姜黄素的逆转倍数分别为1.18，1.43，相对逆转效率分别为14.96%，30.13%；
4. MTT法检测5μg/mL和10μg/mL的姜黄素与 ADR单独以及联合作用后对BEL-7402/5-Fu细胞增殖的影响。结果显示，与姜黄素和ADR单独作用相比，姜黄素与AD R联合作用后细胞存活率明显降低，细胞增殖抑制作用明显增强，；
5.流式细胞术检测细胞内 ADR的蓄积，其结果显示 BEL-7402/5-Fu组较BEL-7402组明显发生蓝移现象，而且加药组波峰随着姜黄素浓度的增加，逐渐发生红移现象，细胞内荧光强度逐渐增强；
6.实时荧光定量qPCR和Western blot蛋白印迹法结果显示BEL-7402/5-Fu细胞内P-gp和LRP mRNA和蛋白的表达显著高于BEL-7402细胞，且P?0.05，差异具有统计学意义；
7.实时荧光定量 qPCR和 Western blot蛋白印迹法结果显示姜黄素能抑制BEL-7402/5-Fu细胞中P-gp和LRP mRNA和蛋白的表达，且姜黄素联合5-Fu作用显著地降低了P-gp和LRP mRNA和蛋白的表达；
8. Western blot印迹法结果显示随着姜黄素浓度的增加，CyclinD1、CyclinD2、Cox-2、Bcl-2、Wnt3a以及β-catenin的表达逐渐下调，Bax的表达逐渐上调，而且当姜黄素与5-Fu联合作用后，CyclinD1、CyclinD2、Cox-2、Bcl-2、Wnt3a以及β-catenin的表达显著地下调，而Ba x的表达显著地上调；
9.流式结果显示，姜黄素能够促进BEL-7402/5-Fu细胞凋亡，且随着姜黄素浓度的增加，凋亡细胞亚群逐渐增多，细胞凋亡率逐渐增加，而姜黄素和5-Fu共处理后，凋亡细胞亚群显著增多，细胞凋亡率显著地增加。与5-Fu组和姜黄素组相比，P?0.05，差异具有统计学意义。
结论：
姜黄素可部分逆转人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-Fu细胞的多药耐药，不仅与下调P-gp和LRP表达以及抑制P-gp外排功能有关，还与下调CyclinD1、CyclinD2以及Cox-2的表达，抑制细胞增殖，下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，抑制促进细胞凋亡以及抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
肿瘤多药耐药（Multi-drug resistance，MDR）是癌细胞对多种化疗药物的一种获得性耐药，是临床上癌症患者治疗成功的主要障碍。虽然治疗肿瘤的研究不断进步，治疗方法日益完善，但是还是有超过50%的肿瘤对化疗药物产生快速耐药性，从而导致患者预后效果不佳[1]。肿瘤MDR的机制十分复杂，往往是由多种基因、多种因素和多种途径共同作用诱导的结果。肿瘤MDR不仅与P糖蛋白（P-gp）介导的经典耐药机制有关，还与凋亡相关基因（Bcl-2、P53、Survivin）、细胞增殖以及相关逆转肿瘤多药耐药的信号通路（NF-κB、State3、Wnt/β-catenin）等非经典耐药机制密切相关。因此，更好地理解药物的耐药机制是开发高效、低毒的新型MDR调节剂（又称化学增敏剂和MDR逆转剂）的关键所在。
姜黄素（Curcumin, Cur）是植物姜黄（Curcuma longa L.）中发挥药理作用的主要活性成分，具有抗炎、抗血管生成、抗氧化以及抗肿瘤等药理作用。近年来，研究显示姜黄素对多种肿瘤的MDR有逆转作用，但对其逆转耐药的研究多集中在P-gp依赖的经典耐药途径。多药耐药的机制非常复杂，往往涉及多条通路、多种基因的共同作用，为了更加深入了解姜黄素逆转多药耐药的机制，本研究目的是通过姜黄素和5-Fu单独以及联合作用于人肝癌耐药细胞株 BEL-7402/5-Fu，检测姜黄素的逆转耐药作用，并且除了从经典的P-gp耐药途径外，还从影响细胞增殖、促进细胞凋亡以及抑制 Wnt/β-cate nin信号通路等途径进一步探讨姜黄素逆转肝癌多药耐药的其他可能机制。
方法：
1.以人肝癌敏感细胞株BEL-7402以及人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-Fu为实验的对象，采用MTT法进行肝癌多药耐药性检测，检测作用前后 BEL-7402细胞和BEL-7402/5-Fu细胞对5-Fu、ADR以及MTX等三种抗肿瘤药物的化疗敏感性，计算这两种细胞对5-Fu、ADR以及 MTX等三种抗肿瘤药物的半数抑制浓度（IC50）和耐药指数（IR）；
2.采用MTT法检测姜黄素对BEL-7402细胞和BEL-7402/5-Fu细胞的内在毒性，绘制细胞增殖抑制曲线，筛选出姜黄素的无毒剂量，并作为逆转耐药的剂量；
3.采用无毒剂量的姜黄素与耐药逆转剂维拉帕米（VRP）和5-Fu单独以及联合作用于BEL-7402/5-Fu细胞，计算细胞抑制率，逆转倍数以及逆转效率；
4.采用无毒剂量的姜黄素与ADR单独以及联合作用于BEL-7402/5-Fu细胞，MTT法测定姜黄素对ADR化疗作用的影响，并计算细胞抑制率；
5.采用流式细胞术检测姜黄素和VRP作用前后对BEL-7402/5-F u细胞内ADR的蓄积的影响；
6.采用实时荧光定量qPCR以及Western blot蛋白印迹法检测BEL-7402细胞以及BEL-7402/5-Fu细胞内P-gp和LRP mRNA以及蛋白的表达；
7.采用实时荧光定量qPCR以及Western b lot蛋白印迹法检测经姜黄素与5-Fu单独以及联合作用后BEL-7402/5-Fu细胞内P-gp和LRP mRNA以及蛋白的表达；
8.采用 Western blot蛋白印迹法检测姜黄素和5-Fu单独或者联合作用前后BEL-7402/5-Fu细胞内CyclinD1、CyclinD2、Cox-2、Bcl-2、Bax、Wnt3a以及β-catenin的表达；
9.使用流式细胞术检测姜黄素和5-Fu单独以及联合作用对细胞凋亡的影响，并计算各组的细胞凋亡率。
结果：
1. MTT检测结果显示，5-Fu、ADR以及MTX等三种抗肿瘤药物对BEL-7402细胞很表现出很高的敏感性，对BEL-7402/5-Fu细胞则表现出较低的敏感性。而且与 BEL-7402细胞相比，BEL-7402/5-Fu细胞对这三种抗肿瘤药物表现出不同程度的耐药性，其耐药指数分别为735.61，2.02，2.09；
2. MTT检测结果发现姜黄素可抑制BEL-7402细胞和BEL-7402/5-Fu细胞的增殖，且随着姜黄素浓度的增加，细胞增殖抑制作用逐渐增强，且呈浓度依赖性。并筛选出姜黄素的无毒剂量，即5μg/mL和10μg/mL；
3.5μg/mL和10μg/mL的姜黄素分别与5-Fu联合作用后，其对BEL-7402/5-Fu细胞增殖抑制作用较单个用药时明显增强，且随着姜黄素浓度的增加，细胞增殖抑制作用逐渐增强。5μg/mL和10μg/mL姜黄素的逆转倍数分别为1.18，1.43，相对逆转效率分别为14.96%，30.13%；
4. MTT法检测5μg/mL和10μg/mL的姜黄素与 ADR单独以及联合作用后对BEL-7402/5-Fu细胞增殖的影响。结果显示，与姜黄素和ADR单独作用相比，姜黄素与AD R联合作用后细胞存活率明显降低，细胞增殖抑制作用明显增强，；
5.流式细胞术检测细胞内 ADR的蓄积，其结果显示 BEL-7402/5-Fu组较BEL-7402组明显发生蓝移现象，而且加药组波峰随着姜黄素浓度的增加，逐渐发生红移现象，细胞内荧光强度逐渐增强；
6.实时荧光定量qPCR和Western blot蛋白印迹法结果显示BEL-7402/5-Fu细胞内P-gp和LRP mRNA和蛋白的表达显著高于BEL-7402细胞，且P?0.05，差异具有统计学意义；
7.实时荧光定量 qPCR和 Western blot蛋白印迹法结果显示姜黄素能抑制BEL-7402/5-Fu细胞中P-gp和LRP mRNA和蛋白的表达，且姜黄素联合5-Fu作用显著地降低了P-gp和LRP mRNA和蛋白的表达；
8. Western blot印迹法结果显示随着姜黄素浓度的增加，CyclinD1、CyclinD2、Cox-2、Bcl-2、Wnt3a以及β-catenin的表达逐渐下调，Bax的表达逐渐上调，而且当姜黄素与5-Fu联合作用后，CyclinD1、CyclinD2、Cox-2、Bcl-2、Wnt3a以及β-catenin的表达显著地下调，而Ba x的表达显著地上调；
9.流式结果显示，姜黄素能够促进BEL-7402/5-Fu细胞凋亡，且随着姜黄素浓度的增加，凋亡细胞亚群逐渐增多，细胞凋亡率逐渐增加，而姜黄素和5-Fu共处理后，凋亡细胞亚群显著增多，细胞凋亡率显著地增加。与5-Fu组和姜黄素组相比，P?0.05，差异具有统计学意义。
结论：
姜黄素可部分逆转人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-Fu细胞的多药耐药，不仅与下调P-gp和LRP表达以及抑制P-gp外排功能有关，还与下调CyclinD1、CyclinD2以及Cox-2的表达，抑制细胞增殖，下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，抑制促进细胞凋亡以及抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。