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目的:
制备具有药理活性的黑米花色素苷并分离纯化其主要的活性部分,通过作用于细胞、动物模型测定一系列的免疫和生化功能指标,揭示其改善机体营养状况、抗氧化、增强免疫功能的作用,从整体和分子水平上探讨其抗氧化、促免疫和抗肿瘤的作用机制。
方法:
1.酸化乙醇法提取黑米色素,再联用树脂柱、凝胶柱层析分离纯化花色素苷,并通过薄层层析、紫外可见光谱分析、高效液相色谱和质谱分析鉴定纯度和结构。
2.大鼠随机分为4组,每组以不同剂量的花色素苷,连续给药30 d。从大鼠股动脉取血,在全自动生化分析仪上测定血液主要生化指标。称胸腺、脾、肝和肾湿重,并计算其湿重指数;生化方法测定胸腺、脾、肝、肾和巨噬细胞内乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和(或)还原型谷胱甘肽(GSH)的活力,并进一步观察巨噬细胞摄取中性红的能力。
3.用CCK-8试剂盒检测花色素苷对小鼠脾细胞的增殖作用,硝酸盐还原酶法检测小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮(NO)的生成量,荧光法检测小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮合酶(iNOS)的活性,RT-PCR检测iNOS mRNA的表达。
4.用不同浓度的花色素苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷分别处理Hela细胞后,CCK-8法测细胞生长抑制率;Hoechst33258染色,激光共聚焦镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测凋亡率;SABC染色检测Bax/Bcl-2的蛋白表达。
结果:
1.检测黑米花色素苷的纯度为37.69%,并鉴定其主活性部分化合物为矢车菊素-3-葡萄糖苷。
2.花色素苷组大鼠血液中尿素氮(UN)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCh)、低密度脂蛋白(LDL)水平都有不同程度的降低,花色素苷组大鼠组织脏器的湿重增加(胸腺、肝),LDH(脾、肝、肾)、ACP(胸腺、脾、肝、肾)、AKP(胸腺、肝、肾)活力、GSH(脾、肝、肾)、SOD(胸腺、脾、肝)水平显著上升,MDA(肝、肾)的含量下降。PMO内ACP、LDH活力显著升高。PMФ和AMФ中的SOD活力升高,降低MDA的水平,而且能显著增强大鼠PMФ、AMФ的吞噬能力。
3.花色素苷可促进脾细胞的增殖,并在一定浓度下呈剂量依赖效应;能刺激小鼠腹腔巨噬细胞NO的生成,提高一氧化氮合酶(NOS)的活性,其中矢车菊素-3-葡萄糖苷可以诱导iNOS mRNA的表达。
4.25~400 mg/L花色素苷和12.5~200μmol/L矢车菊素-3-葡萄糖苷可抑制Hela细胞生长,抑制率呈时间剂量依赖性;激光共聚焦镜下可见到明显的凋亡细胞;流式细胞仪检测显示可以提高凋亡率;免疫组化检测表明Bax表达上升,Bcl-2表达下降。
结论:
1.证实黑米中花色素苷主要活性成分为矢车菊素-3-葡萄糖苷。
2.花色素苷可以降低大鼠血液主要生化指标中尿素氮(UN)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCh)、低密度脂蛋白(LDL)的水平,通过调节LDH、ACP、AKP、SOD、MDA和(或)GSH的活性对巨噬细胞和组织器官起保护作用,其中提高LDH、ACP的水平激活巨噬细胞活性和吞噬功能,表明花色素苷对机体具有重要的免疫调节功能。
3.花色素苷有促进小鼠脾细胞的增殖作用并通过增加一氧化氮合酶(NOS)合成,进而刺激小鼠巨噬细胞NO的生成,其中矢车菊素-3-葡萄糖苷可以诱导小鼠巨噬细胞iNOS mRNA转录。表明花色素苷具有促进免疫的活性。
4.花色素苷与矢车菊素-3-葡萄糖苷都可抑制Hela细胞生长,诱导其凋亡,其诱导凋亡的作用的机制与凋亡相关基因促凋亡基因Bax表达上调,抗凋亡基因Bcl-2表达下调有关。