论文部分内容阅读
目的：ANFH是遗传易感因素和环境危险因素共同作用的复杂性疾病, ANFH基因遗传多态性与发病风险的相关研究,可为ANFH易感人群筛查、早期诊断和早期干预提供重要科学依据。建立在股骨头缺血性坏死分子发病机理研究进展基础上,选择SREBP-2、IGFBP-3两个基因作为研究的靶基因,综合应用多种分子技术的创新集成,分析靶基因多态位点与ANFH发病的风险及临床表现型的相关性,从分子遗传学及基因功能的角度筛查与股骨头缺血性坏死发生发展的关键靶分子,为建立ANHF的分子水平防治对策提出关键分子靶点。方法：股骨头坏死入组病例选自于2009年6月至2010年12月就诊于吉林大学中日联谊医院骨科的临床患者49例,排除明显髋关节的外伤史,按Ficat诊断与分期标准进行ANFH的临床诊断与分期,并按临床病因学分类分为激素性股骨头坏死、特发性股骨头坏死、酒精性股骨头坏死三类。健康对照组按知情同意的原则选自与股骨头坏死入组病例年龄、性别相匹配的健康体检者42例。应用文献循证方法选择与ANFH的发生发展及骨代谢有密切关的固醇调节元件结合蛋白基因2(SREBP-2)、胰岛素样生长因子结合蛋白3基因(insulin-like grouth factor bind protein 3,IGFBP3)基因,作为基因多态性研究的目标基因。其中SREBP-2检测SNP位点为rs2267439、rs 2267443；IGFBP3检测的SNP位点为rs2453839。采用聚合酶链反应(PCR)、基因测序等分子技术的创新集成,检测目标基因多态性；通过SPSS10.0统计学软件等分析这些基因多态性在ANFH组和正常对照组中的分布特点,基因多态性与临床表现型之间的关系,以及基因多态位点之间的交互作用。结果：本研究取得以下结果：1.综合应用分子克隆、荧光定量PCR、分子测序等多种分子技术的创新集成,在91例ANFH组及健康对照组体系中成功克隆了SREBP-2、IGFBP3基因3个多态性位点的基因片段,经电泳及测序检测证实所克隆的基因片段条带清晰,电泳条带位置与所设计目标基因片段分子量一致,碱基序列与GeneBank目标基因片段序列完全吻合。本研究以测序技术金标准为核心技术的方法体系不仅提高了检测的特异性与灵敏性而且为进一步进行ANFH易感基因相关的表观遗传学及转录与翻译水平表达的研究奠定了实验基础。2.应用分子测序技术证实了SREBP2基因rs2267439SNP位点的多态性为CC,CT,及TT三种类型：rs2267443SNP位点的多态性为GG,、AA及GA三种类型。ANFH组rs2267439SNP位点的TT型基因型频率(34.0%vs23.8%)和rs2267443SNPGA型基因型频率(34.1%vs24.3%)分别较正常对照组频率有上升的趋势,提示rs2267439等位基因纯合子TT基因型携带者和rs2267443GA型基因型携带者可能会增加ANFH患病风险。3.基因之间交互作用的分析结果发现,SREBP-2基因两个多态位点rs2267439(T/T)与rs2267443(G/A)基因型在ANFH组和对照组中的分布具有统计学差异,表明(T/T)与(G/A)基因型之间的相互作用可能增加ANFH风险。提示同时携带两种突变基因型——T/T型和G/A型,可在ANFH发生中呈协同作用,所致ANFH发病率风险明显高于单独携带其中一个基因型的患者。阐述了ANFH是一种多基因遗传病,多个易感基因突变更易导致ANFH发病。4.基因测序结果证实了IGFBP3基因的rs2453839位点的多态性为CC、TT及CT三种类型。尽管rs2453839基因型及等位基因频率在ANFH组与正常对照组之间的分布未见统计学差异,但ANFH的TT型基因型频率(52.0%vs 71.4%)呈现低于正常对照组的趋势；而ANFH的TC型频率(40.0%vs 20%)则呈现高于正常对照组的趋势。对IGFBP3基因rs2453839位点的多态性与ANFH发病风险的评估,有待于扩大样本量的深入研究。5.对ANFHIGFBP3rs2453839基因型与临床表现型的对比分析结果,发现携带TT型基因型的ANFH患者病程显著短于CT+CC型携带者(P<0.01);双侧Ⅱ-Ⅲ期患者携带TT型基因型多于CT+CC型携带者(P<0.05);病变累及范围单侧髋关节受累患者TT型亦多于CT+CC型携带者(P<0.05),首次证实了IGFBP3rs2453839基因多态性与ANFH患者的临床表现型呈现一定程度相关性。结论：我们的研究结果在国内外率先提出了SREBP-2、IGFBP3基因多态性与中国北方汉族人群ANFH风险的相关依据,两种基因多态性可能是中国北方汉族人群股骨头缺血性坏死最重要的遗传易感因素之一。对SREBP-2、IGFBP3基因遗传易感位点、表观遗传学、基因表达效率、临床表现型的系统深入研究,可能有助于进一步阐述基因多态性与股骨头缺血性坏死的发生发展的关系,也为临床ANFH的分子水平防治——ANFH易感人群筛查、早期诊断和早期干预提出了主要监控的分子靶标。