梭菌病是由梭菌属(Clostridium)中致病性菌种引起的疾病的总称。通常包括产气荚膜梭菌、腐败梭菌、破伤风梭菌等。其中对于我国威胁最大的便是产气荚膜梭菌和腐败梭菌。梭菌病发病急促,病程短,死亡率高。动物一旦发病往往来不及治疗便发生死亡。因而免疫接种是预防本病的最为直接有效的方法。目前国内的三联四防疫苗其主要抗原成分多为菌体或类毒素,而腐败梭菌作为一种严格厌氧菌,本身的培养难度大,产毒能力弱,使得疫苗的防护能力大打折扣。通过基因工程表达的重组腐败梭菌α毒素可以保留天然毒素的免疫原性,同时生产工艺简单,可以用于三联四防疫苗的升级换代。因此,本研究拟制备C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗。在本研究中,对C型产气荚膜梭菌(NCTC 3180)和D型产气荚膜梭菌(NCTC 8346)进行复苏、增菌和产毒。利用一次性细菌滤器过滤除菌获得毒素溶液。并利用本实验室构建完成的表达重组腐败梭菌α毒素的质粒通过原核表达系统生产重组蛋白。将C、D型产气荚膜梭菌天然毒素和重组腐败梭菌α毒素按一定比例混合后经过甲醛灭活后,加入白油佐剂制得二联二价疫苗。对制备的疫苗进行物理性状检查、无菌检查、安全性检查和动物保护试验。结果表明,上述所制备的毒素在用终浓度为0.3%的甲醛灭活96 h后能够完全灭活,且能够保持良好的抗原性。制备的二价二联疫苗检验结果符合中华人民共和国兽用生物制品质量标准。在对小鼠免疫0.2 mL疫苗后,保护率可达100%。对6-7月龄的绵羊接种5 mL疫苗21天后,通过间接ELISA和毒素中和试验对绵羊血清中抗体效价水平进行评估,发现绵羊血清中抗C型产气荚膜梭菌毒素的抗体效价为1:3200,抗D型产气荚膜梭菌毒素的抗体效价为1:6400,抗腐败梭菌毒素的抗体效价为1:6400;而中和效价分别为400,800和800。根据《中国兽药典》2010年版三部的规定,血清中和效价对快疫达到1(即0.1 mL免疫动物血清可中和1 MLD毒素),对肠毒血症达到3(即0.1 mL免疫动物血清可中和3 MLD毒素),即可判为疫苗合格。说明本实验所制备的疫苗效价高且安全可靠,可以用于针对牛羊等反刍动物的梭菌病的预防,并未为将来研制三联四防疫苗打下基础。