研究背景及目的癌症是一种多步骤、多阶段及多基因参与的疾病。同其他类型的肿瘤一样,膀胱癌的发生和发展是通过在基因水平和表观基因水平影响细胞的增殖和程序性死亡(凋亡)来调控的。凋亡及抗凋亡基因相互平衡决定每一个细胞的存活或凋亡。抗凋亡基因的异常表达会导致细胞生存期延长,从而启动肿瘤开始程序,加快进程或转移。伴随着人类基因组计划的完成,各种基因的筛选已成为目前基因研究的热点,而探索肿瘤进展和转移的相关基因对判定肿瘤的预后、指导治疗措施的选择及研发新的治疗措施和方案都具有重要的指导意义。其中最重要的凋亡调控蛋白家族有两个：Bcl-2蛋白家族和凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis family of protein, IAPs)。IAPs包括1-3个杆状病毒IAP重复结构域(BIR),每个BIR结构域由大约60-70个氨基酸组成,重复结构域(BIR)被认为是在抗凋亡作用中起主要作用的区域。1997年由耶鲁大学Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体-1(efector cell proteaserecep tor-1, EPR-1)的cDNA在人类基因库种筛选克隆一种凋亡抑制基因Survivin,它是凋亡抑制蛋白家族中发现的功能最强的凋亡抑制蛋白,它通过抑制凋亡、调节细胞周期参与了肿瘤的发生和发展。它在人类常见的大多数恶性肿瘤中表达,但在正常分化组织中极少表达。目前,国内外研究发现survivin基因在膀胱肿瘤的发生发展中具有重要作用,指出survivin敏感性及特异性较高,可以作为膀胱癌诊断和预后判断的的标志物。随着对其深入研究,发现其存在多种剪接变异体,其中survivin-2B和survivin-ΔEx3因其功能和作用的独特而受到重视。Survivin-2B在survivin的基础上增加了69bp的外显子2B,编码产生165个氨基酸外显子2B的插入干扰BIR结构域,使survivin-2B的抗凋亡活性明显下降。survivin-AEx3被选择剪切掉外显子3,并引起外显子4区域编码顺序的改变,终止密码子后移至3’端非翻译区,编码137个氨基酸,产生增强的抗凋亡活性。目前一些研究表明,survivin-2B和survivin-ΔEx3在肿瘤的发展中显示了不同的作用。在软组织肉瘤及胃癌中可检测到survivin及其剪接变异体survivin-2B和survivin-ΔEx3存在。在脑部肿瘤中survivin,survivin-ΔEx3的表达高于良性对照组,survivin-ΔEx3在恶性脑肿瘤中高表达,而survivin-2B在良性组织中高表达。然而迄今为止关于膀胱尿路上皮癌中survivin剪接变异体的表达的研究较少。膀胱尿路上皮癌是我国泌尿系最常见的恶性肿瘤,浅表性膀胱癌的治疗方法主要为经尿道肿瘤电切术,术后辅助化疗药物膀胱灌注。治疗后复发率可高达61%,大部分还会出现分级、分期的进展或者发生转移,从而丧失根治手术的机会。目前认为导致膀胱肿瘤术后较高复发率因素有：(1)膀胱癌病理类型是影响其局部复发的主要因素,特别是盆腔复发的危险性与肿瘤的病理类型直接相关；(2)膀胱肿瘤局部复发与原发肿瘤的分期、分级也有相关性,并按顺序依次递增；(3)显露困难操作受限致切除范围不够深,而引起切缘癌组织残留导致癌术后复发；(4)术后不能进行正规的膀胱灌注及定期随访。故对预后的判断、随访观察尤其重要。目前膀胱癌的诊断和随访观察主要依赖于膀胱镜检查及病理学活检,通过膀胱镜检查可以发现膀胱是否出现肿瘤,可以明确肿瘤的数目、肿瘤大小、形态及发生部位。并且可以对肿瘤或可疑病变部位进行活组织病理学检查以明确诊断。但其为有创性检查,存在导致患者痛苦、漏诊早期病变、并发症多等缺点。因此寻找敏感性、特异性高的膀胱癌生物标志物,将会对疾病预后判断,复发与否有指导意义；同时也可作为肿瘤靶向治疗的新靶点。本研究着重对膀胱尿路上皮癌中survivin及其剪接变异体survivin-2B和survivin-ΔEx3的表达进行研究,分析其表达与临床病理资料的相关性。研究方法(1)材料2007年12月至2009年6月我院泌尿外科手术切除的标本,膀胱尿路上皮癌标本55例(包括初发及复发),经病理证实,术前未予化疗和放疗。男性45例,女性10例,年龄30-87岁,中位年龄62.9岁。据WHO 2004病理分级：低级别25例,高级别30例；TNM临床分期系统分组：Ta-T136例,T2-T419例。取肉眼正常癌旁组织10例,同期前列腺增生患者正常膀胱组织10例作对照组。取组织无菌生理盐水冲洗,取大小约0.2cm3放入EP管中立即置于-80℃冰箱保存,其余送病理检查。Survivin兔抗人单克隆抗体(齐康生物)、SP免疫组化试剂盒(博士德),Trizol试剂、RT-PCR试剂盒、PCR所用引物及探针(达安公司),ABI 3900台式高通量DNA合成仪,科大创新HC-3018R高速冷冻离心机,ABI9700 PCR仪,ABI 7500全自动荧光定量PCR仪。(2) RT-PCR法测定组织中Survivin,survivin-2B和survivin-ΔEx3表达取适量组织至新的1.5mlEP管中,用玻璃棒研磨,加入Trizol 1ml,充分振荡混匀,加入氯仿0.2ml,盖紧盖子,用力摇动15s,15-30℃孵育2-3min,4℃12000r/min离心15mmin,取上清液至新的1.5mL EP管,总RNA提取按照Trizol说明书进行,选择β-actin作为内参基因,GenBank上查找基因mRNA序列,Primer express 2.0软件设计引物如下：5’-TCC ACT GCC CCA CTG AGA AC-3’和5’-CCT TCC AGC TCC TTG AAG CA-3’扩增Survivin (67bp); 5’-GCGGATCACGAGAGAGGAAC-3’和5’-AGTTTCAAAAATTCACCAAGGGTTA-3’扩增survivin-2B (102bp) 5’-AGTTTCAAAAATTCACCAAGGGTTA-3’和5’-GAATTTGAGGAAACTGCGGAGA-3’扩增survivin-ΔEx3(119bp); 5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’和5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’扩增内参β-actin(106bp)。合成引物应用ABI 3900台式高通量DNA合成仪。取4μlRNA模板做逆转录反应,标准曲线定量法参照说明书制备阳性标准品及其梯度,阴性质控标准品采用灭菌双蒸水。待测样本和阳性标准品进行荧光定量PCR反应,PCR反应条件为：93℃3分钟,93℃30秒,55℃45秒,72℃45秒,共40循环。反应结束后,由电脑自动分析并计算结果。通过测量Survivin、survivin-2B和survivin-AEx3基因和内参照基因β-actin的扩增片断密度的比值,计算出相对表达量。数据经统计软件SPSS 13.0对Survivin及其剪接变异体survivin-2B和survivin-ΔEx3 mRNA在膀胱癌与正常组织之间及55例膀胱癌患者中分别就肿瘤病理分级、临床分期及复发等的相对表达量数据进行分析处理,均数比较采用T检验,选取检验水准a=0.05。(3)免疫组化染色采用免疫组织化学二步法,切片脱蜡、水化后进行抗原修复并清除过氧化物酶,切片加上1：100稀释的一抗survivin,37℃120min, PBS洗2mmin×3次,滴加二抗工作液A液,37℃孵育20min,PBS洗2min×3次,滴加二抗工作液B液,37℃孵育20 min, PBS洗2min×3次,DAB显色2-5min,显微镜下控制,自来水冲终止反应,苏木素复染约1min,自来水冲蓝化5min,梯度酒精脱水二甲苯透明后中性树胶封片,用PBS代替一抗做阴性对照。结果判断由两名病理科医生采用盲法阅片的方式进行,结合北航图像分析系统软件来帮助进行结果判断。结果判定标准：免疫组化产物阳性呈浅黄色-棕褐色细颗粒状,survivin蛋白阳性表达定位于细胞浆。每张切片选取5个高倍视野(×400倍),每个视野随机计数100个细胞,求其平均阳性率阳性细胞比例的均值≥25%为表达阳性。否则为阴性。研究结果：Survivin、survivin-2B和survivin-ΔEx3 mRNA在膀胱尿路上皮癌中均有表达,表达量为0.560±0.286,0.050±0.025,0.467±0.229;对照组中survivin-2B皆有表达,表达量为0.017±0.010, Survivin、survivin-ΔEx3仅5例及6例微量表达,表达量为0.003±0.006,0.003±0.003。癌组织中的表达水平比正常组织明显上调,差异有显著性(P<0.01)。考虑survivin及其剪接变异体在肿瘤的发生发展中起到一定的作用。不同病理分级和临床分期的膀胱尿路上皮癌,Survivin、survivin-2B和survivin-ΔEx3 mRNA的表达差异有统计学意义(P<0.01)。随着病理分级、临床分期的升高, Survivin和survivin-ΔEx3 mRNA的表达升高；而survivin-2B mRNA表达则降低。推测survivin-ΔEx3可能具有和survivin类似的作用。从另一方面证实了survivin和survivin-ΔEx3具有抗凋亡作用,而survivin-2B的抗凋亡作用减弱了。同时推测survivin-2B可能具有拮抗survivin和survivin-ΔEx3抗凋亡功能的作用。55例膀胱尿路上皮癌组织中阳性表达例数46例,阴性表达例数9例,Survivin表达的阳性率为83.6%；20例正常膀胱粘膜组织中阳性表达例数2例,阴性表达例数18例,Survivin表达的阳性率为10%。进行卡方检验,χ2值为34.517,P值为0.000因此,膀胱尿路上皮癌组织中Survivin表达的阳性率高于正常膀胱粘膜组织。(P<0.01)研究结论：1.膀胱尿路上皮癌组织中Survivin、survivin-2B和survivin-ΔEx3的表达水平比正常组织明显上调,表明Survivin及其剪接变异体在膀胱尿路上皮癌组织中存在过表达,对于膀胱尿路上皮癌的发生与发展有重要作用。2. Survivin、survivin-2B和survivin-ΔEx3在膀胱尿路上皮癌的发生和发展中起不同作用,并且和病理分级、临床分期都具有一定的相关性。