过敏性炎症与临床上常见的一些疾病如过敏性鼻炎、哮喘、皮炎等有关,是人类的重大疾病之一,其发病率约占世界人口的30%-40%,而且正以每年大于1%的速度增加,以儿童的患病率上升最为明显。随着我国现代化、工业化水平的提高,生活西方化,过敏性疾病的发病率也逐年上升。因此,对于其发病机制、影响因素与防治的研究也再度成为热点。研究目的:过敏性皮炎模型是过敏性疾病的代表性模型之一,本实验室前期研究发现玉屏风散提取物能够有效抑制变应性接触性皮炎(Allergic contact dermatitis,ACD)及哮喘等Th2型过敏性疾病,黄芪为玉屏风散中的君药并有很明显的免疫调节作用[1],而黄芪的重要单体成分黄芪甲苷(AstragaiosideⅣ,AS-Ⅳ)髓,3]对Th2型过敏性炎症是否有抑制作用,作用机制是什么,其是否是玉屏风散该种作用的有效成分之一尚无实验证实。本研究应用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothyocyanate,FTTC)诱导的Th2型小鼠ACD的模型,评价AS-Ⅳ的作用、作用阶段以及作用机制。并通过poly(I:C)及TNF-α刺激上皮细胞产生胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)的模型进一步验证AS-Ⅳ的作用,为玉屏风散的抗过敏效应物质基础研究提供数据,为临床应用提供依据,同时为过敏性疾病的治疗提供新的方向。研究方法:1、Th2型ACD模型建立方法BALB/c小鼠在day 1,day 2用1.5%的FITC溶液致敏腹部皮肤2次,day 6用0.5%FITC溶液攻击小鼠右耳部皮肤,空白涂相同体积的溶剂,24 h后测定小鼠耳肿胀程度(耳厚、耳重),同时局部耳组织制匀浆待测,并做病理组织学检查。2、Th2型ACD致敏初期TSLP产生模型的建立在day 1,day 2用0.5%FITC溶液攻击小鼠左右耳部皮肤,空白涂相同体积的溶剂,day 3取局部耳组织待测。3、AS-Ⅳ给药方法(1)AS-Ⅳ全程给药方法BALB/c小鼠在day 1给予AS-Ⅳ(6.25,12.5,25,50 mg/g,ig)至day7,地塞米松ip剂量为0.67 mg/kg,空白与模型组给予生理盐水,day 7给药后1h测定小鼠耳肿胀程度。(2)AS-Ⅳ诱导相给药方法BALB/c小鼠在day 1给予AS-Ⅳ(6.25,12.5,25,50 mg/kg,ig)至day 5,地塞米松ip剂量为0.67mg/kg,空白与模型组给予生理盐水,day7取材。(3)AS-Ⅳ效应相给药方法BALB/c 小鼠在 day 6 攻击前 1 h、攻击后 4 h、8 h、23 h 给予 AS-Ⅳ(6.25,12.5,25,50mg/kg,ig),地塞米松ip剂量为0.67mg/kg,于攻击后24h测定小鼠耳肿胀程度。(4)AS-Ⅳ诱导初期给药方法BALB/c小鼠提前两天给予AS-Ⅳ(6.25,12.5,25,50 mg/kg,ig)至day3,地塞米松ip剂量为0.67 mg/kg,空白与模型组给予生理盐水,day 3给药完1 h取材。4、人原代角质形成细胞(HumanKeratinocyte,HKC)培养及鉴定青少年包皮环切术后的组织由南京建国男科医院提供。将青少年包皮环切术后的组织无菌处理,分离细胞,利用免疫细胞组织化学染色方法检测细胞角蛋白5的表达来进行细胞鉴定。5、poly(I:C)刺激HKC产生TSLP模型建立利用poly(I:C)终浓度为100 μg/ml刺激HKC 24 h,ELISA法测定细胞上清中TSLP的分泌。6、poly(I:C)与TNF-α联合刺激HaCaT产生TSLP模型建立利用poly(I:C)终浓度100μg/ml与TNF-α终浓度20 ng/ml刺激HaCaT 24 h,ELISA法测定细胞上清中TSLP的分泌。7、免疫荧光测定细胞的种板及AS-Ⅳ给药将细胞种于内含爬片的48孔板内,将细胞分为7组,分别为空白组、刺激组、AS-Ⅳ四个浓度组以及阴性对照组,每个浓度组各设3个复孔,待种板的细胞融合90-100%后,药物预孵育6h后加入刺激剂刺激细胞,24 h后收集上清ELISA方法检测,爬片上的细胞用于免疫荧光检测。8、指标检测用测厚规测量小鼠耳厚,称量耳重,病理组织学检查采用,HE染色,ELISA法测定耳组织匀浆中IL-4 IL-5、IL-9、IL-13、TSLP 水平,real-time PCR方法检测局部耳组织中 TSLPmRNA、TSLPRmRNA、NF-JBmRNA、TLRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR8、TLR9)mRNA、Jagged1 mRNA、Notch1 mRNA 的表达。免疫荧光方法检测细胞内TSLP的表达。研究结果:1、AS-IV全程给药能够显著抑制Th2型ACD与空白组比较,模型组小鼠耳肿胀明显,Th2型细胞因子IL-4,IL-5,IL-13,IL-9水平显著升高;AS-IV给药后能显著抑制模型的耳肿胀度,降低耳组织匀浆中IL-4,IL-5,IL-13,IL-9 水平。2、AS-IV对Th2型ACD的作用主要在诱导相阶段AS-IV诱导相给药发现,与空白组比较,模型组小鼠耳肿胀明显,耳组织真皮层明显水肿,炎症细胞大量浸润,Th2型细胞因子IL-4,IL-13,IL-9水平显著升高;AS-IV 25,50 mg/kg诱导相给药能显著抑制模型的耳肿胀度;病理组织学检查亦显示,与模型组比较,给予AS-IV小鼠的耳炎症反应减轻,炎细胞浸润明显减少;同时能显著降低耳组织匀浆中IL-4,IL-13,IL-9水平。然而,AS-Ⅳ效应相给药后发现,AS-Ⅳ仅个别剂量能够降低模型组耳重或IL-4或IL-9的表达。多因素方差分析方法分析综合指标抑制率,结果发现:诱导相给药与全程给药的效应程度是相似的,而效应相给药与全程给药相比效应明显减弱,故AS-IV对Th2型ACD的作用主要集中在诱导相阶段。3、AS-Ⅳ能够显著抑制Th2型ACD致敏初期小鼠耳组织以及体外刺激HKC和HaCaT中TSLP的表达在FITC诱导的致敏初期TSLP产生的模型中,与空白组比较,模型组小鼠TSLP蛋白的表达明显增加,给予AS-Ⅳ后TSLP蛋白的表达显著降低。同时PCR结果显示模型组小鼠TSLP mRNA的表达显著提高,给予AS-Ⅳ后能够显著降低TSLP mRNA 的表达。在 poly(I:C)刺激 HKC 及 poly(I:C)+TNF-α 联合刺激 HaCaT产生TSLP模型中,与空白组比较,模型组的TSLP产生显著提高,给予AS-Ⅳ后,模型组TSLP的产生显著降低;免疫荧光结果亦发现AS-Ⅳ能显著降低HKC及HaCaT细胞内TSLP的表达。4、AS-Ⅳ能够调节TLRs-NF-κB主要信号分子的表达以及Notch 1 mRNA、Jagged 1 mRNA信号分子的表达在Th2型ACD小鼠致敏初期TSLP产生模型实验中,PCR结果显示模型组小鼠NF-κB mRNA、TLR3 mRNA的表达显著提高,给予AS-Ⅳ后能够显著降低NF-κB mRNA的表达,下调TLR3 mRNA的表达。此外,AS-Ⅳ还能降低TLR2 mRNA和TLR8 mRNA的表达。AS-Ⅳ对Jagged1 mRNA与Notch1 mRNA的表达未见明显影响。研究结论:1、AS-Ⅳ对以FITC诱导的小鼠Th2型ACD过敏性炎症有显著的抑制作用,且其主要作用环节在诱导相。2、AS-Ⅳ抑制致敏初期上皮细胞来源的TSLP产生可能是其发挥作用的重要机制,该作用可能与调控TSLP产生相关通路TLRs-NF-κB轴有关。3、AS-Ⅳ是玉屏风散防治过敏性疾病的效应成分之一。