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人类第9号染色体长臂3区4带与第22号染色体长臂1区1带之间的移位而形成的对慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia;CML)有特殊诊断价值的标记染色体-Ph染色体,存在于90%以上的CML病人中。伴随Ph染色体的产生所形成的具有持续酪氨酸激酶活性的Bcr/Ab1融合蛋白,在CML的发生发展中起着关键性的作用。因此,针对酪氨酸激酶的靶向抑制剂STI571,已被证明是目前治疗CML最有效的药物。然而,国内外的临床研究发现,部分CML患者可在短期内对STI571发生耐药,大部分服用用STI571的CML患者在其疾病的加速期和急变期都会对STI571产生耐药性。 最近的研究已经提示,这种耐药现象的发生可能是Bcr/Ab1阳性细胞发生Bcr/Ab1基因的扩增和过度表达的结果:另外,MDR基因及其产物P-糖蛋白的过度表达也可能与耐药形成有关。然而,这些解释可能只能用以解释一小部分临床上STI571的耐药现象。越来越多的证据提示,CML起源于肿瘤干细胞,即CML的白血病干细胞,其分化出的相对成熟的子代细胞构成了白血病细胞的主体,STI571对这部分白血病细胞具有明显的生长抑制作用,而CML的白血病干细胞可能和正常的干祖细胞一样,对STI571是部分、甚至是完全耐药。遗憾的是,CML白血病干细胞对STI571的耐药机制至今仍无答案,这主要是由于鉴别、操纵单个干细胞存在技术上的困难,至今仍然没有关于在单细胞水平上分离纯化并鉴定CML的白血病干细胞的报道,更无从研究其生物学特性了。 本研究的第一部分旨在进一步阐明一些高表达P-糖蛋白(P-glycoprotein;P-gp)的CML白血病细胞对STI571耐药的机制。通过对K562细胞系长期的鬼臼乙叉甙(VP16)诱导和克隆筛选,建立了一株多药耐药细胞系K562/VP16;利用干细胞高效能将Hoechst 33342荧光染料泵出细胞的特性,采用流式细胞术,从K562/VP16细胞系中分选出一小群边缘细胞(side population;SP),称为K562/VP16 SP细胞,并初步探讨了其抗STI571的机制。结浙江大学博士研究生学位论文果显示:Ber一Abl和Abl蛋白在K562细胞、K562/VP16 SP细胞及非K562/VP16 SP细胞(Non一51,K562/VP16)中的表达水平无明显差异:P一gp在K562细胞中不表达,在K562/VP16 SP及Non一SPK562/VP16细胞中均高表达且表达水平一致;与Non一SP K562/VP16细胞比较,K562/VP16 SP细胞对STI571的耐药性更强,并且这种抗性几乎不能被多种多药耐药逆转剂逆转;另外,体内外实验显示,K562/VP16细胞的致瘤性几乎全部来源于K562/VP16邵细胞。因此,Bcr/Ab基因的扩增和过度表达及多药耐药基因及其蛋白表达产物P一即的高表达也许并不是白血病细胞产生对STI571临床耐药的重要机制;白血病细胞对ST1571耐药的发生,可能与数量极少的白血病干细胞有直接的关系;这类数量极少的干细胞样的肿瘤细胞应当成为有效治疗肿瘤的靶细胞。 已有充分的证据表明,白血病起源于恶性增殖性克隆性细胞。在构成白血病的实质细胞中,仅有极少的一部分细胞具有持续自我更新与分化的潜能,这部分细胞即被称为白血病干细胞。白血病干细胞是维持白血病病理状态的首要和必要条件。Bonnet等的研究提示,急性髓细胞性白血病可能起源于C034+CD38一的白血病干细胞。最近,Gunsilius及其同事的研究结果提示,CML可能是起源于比CO34‘CO38一更为早期的干细胞,即血液血管干细胞水平。本研究的第二部分,我们从巧位经确诊为Bcr/Abl融合基因阳性的CML患者的骨髓中分离出了一Flkl十CD34一细胞,体外实验证实该细胞能在单细胞的水平分化为恶性造血细胞即Bcr/Abl融合基因阳性的白血病细胞和Bcr/Abl融合基因阳性的血管内皮细胞;体内实验提示该细胞可在严重联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID小鼠)体内成功建立一类似于人类所患的CML的疾病模型。这些研究结果首次以直接证据表明Bcr/Abl融合基因的产生至少发生在比CO34’CO38-更为早期的血液血管干细胞水平上,即CML至少起源于血液血管干细胞。 本研究的第三部分旨在进一步了解STI571(Glivec)对CML患者体内Bcr/Abl融合基因阳性的原始及处于分化阶段的白血病干/祖细胞分化和增殖的影响,从而更深入阐明部分CML患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对STI571耐药的机制。我们利用从CMI骨髓分离到的具有血液血管千细胞特性的、Bcr/Ab融合基因阳性、免疫表型为Flkl」CO34一的细胞,体外检测了STI571对其在造血集落培养基中的分化及处于不同分化阶段时的增殖抑制作用。结果显示:浓度为5林M sTI571,维持作用96小时(病人体内维持96小时的STI57!浓度只可能达到!一2林M),即可有效抑制定向造血祖细胞的增殖;没