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我们前期利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别在家蚕中部丝腺和后部丝腺中敲除let-7 micro RNA,发现中部丝腺和后部丝腺均增长变粗,后部丝腺敲除let-7后,家蚕的吐丝量显著增加。我们前期已证实丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase,PC）是let-7在家蚕中部丝腺的靶基因,但let-7在后部丝腺的靶基因还有待确定。本研究利用定量蛋白质组学方法,对let-7在后部丝腺的靶基因进行了筛选和鉴定;利用非靶标代谢组学技术对let-7敲除后的后部丝腺代谢物进行分析;对定量蛋白质组学和非靶标代谢组学数据进行关联分析以进一步探索let-7调控丝腺发育的分子机制。获得的主要研究结果如下:1.家蚕后部丝腺let-7敲除后差异蛋白分析我们对五龄3天let-7敲除组（△let-7-PSG）和对照组（D9L）品系家蚕的后部丝腺共6个样品进行了定量蛋白质组分析,共鉴定了5,833个蛋白。以P-value<0.05且Foldchange<0.83或Foldchange>1.2为标准筛选到了177个差异表达蛋白,其中111个上调,66个下调。GO富集分析显示:后部丝腺差异表达蛋白主要在有机物代谢生物学过程中富集,其次在细胞蛋白质代谢、肽代谢和核苷酸代谢中也有富集。KEGG Pathway通路富集分析显示:后部丝腺差异表达蛋白主要在与能量代谢相关的新陈代谢、过氧化物酶体、果糖和甘露糖代谢、糖酵解/糖异生等代谢通路中富集,在嘌呤代谢和嘧啶代谢通路中也有富集。这些结果表明,let-7可能通过调控丝腺细胞的能量代谢来影响后部丝腺的生长发育。2.家蚕后部丝腺let-7靶基因验证定量蛋白质组学筛选到的111个上调差异表达蛋白基因作为let-7的潜在靶基因。在家蚕中能被RNAhybrid、mi Randa和Target Scan三种靶基因预测软件同时预测到的let-7潜在靶基因共504个。将504个潜在靶基因和111个上调差异表达蛋白基因求交集,得到10个候选靶基因。利用3’RACE实验扩增了其中9个基因的3’UTR,将它们构建到双荧光素酶报告基因载体上,分别与let-7 mimic共转染到HEK-293T细胞中。检测结果显示:脱氧核糖二嘧啶光解酶（deoxyribodipyrimidine photo-lyase,PHR）、NADH脱氢酶（泛醌）复合物I（NADH dehydrogenase（ubiquinone）complex I,assembly factor 6,NDUFAF6）、前pi RNA 3’-核酸外切酶三聚体（pre-pi RNA 3’-exonuclease trimmer-like,PNLDC1）、VWFA和包含缓存域的蛋白质1（VWFA and cache domain-containing protein 1,CACHD1）、7-甲基鸟苷磷酸特异性5’-核苷酸酶（7-methylguanosine phosphate-specific 5’-nucleotidase,c N-IIIB）、可能的泛素羧基水解酶cre B（probable ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase cre B,USP1）、弗洛蒂林2（flotillin-2,Flot2）七个基因的荧光素酶活性显著降低,表明它们是let-7的靶基因。3.家蚕后部丝腺let-7敲除后差异代谢物分析我们对五龄3天let-7敲除组（△let-7-PSG）和对照组（D9L）品系家蚕的后部丝腺共16个样品进行了非靶标代谢组分析,共鉴定了5,417个代谢物。对这5,417个代谢物进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）。结果显示:敲除组和对照组样本之间存在明显的代谢差异。以VIP>1且P-value<0.05的标准筛选差异代谢物,筛选出97个差异代谢物,其中69个上调,28个下调。KEGG Pathway通路富集分析显示:后部丝腺差异代谢物主要在嘌呤代谢途径中显著富集,其次在嘧啶代谢和色氨酸代谢通路中也有一定的富集。代谢通路分析显示:后部丝腺差异代谢物主要在苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢和色氨酸代谢通路富集。4.家蚕后部丝腺蛋白质组学和代谢组学关联分析通过蛋白质组学和代谢组学联合分析研究差异表达蛋白和差异代谢物之间的联系,以探索let-7调控后部丝腺生长发育的分子机制。联合分析结果显示:在嘌呤代谢途径中,c N-IIIB、3’-磷酸腺苷（3’-AMP）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（d GMP）和鸟嘌呤核糖核苷酸（GMP）表达量均显著上升,促使细胞内腺嘌呤脱氧核苷酸三磷酸（d ATP）和鸟嘌呤脱氧核苷酸三磷酸（d GTP）大量合成。在嘧啶代谢途径中,c N-IIIB、胞嘧啶（Cytosine）、尿嘧啶核糖核苷酸（UMP）和假尿苷（Pseudouridine）表达量也都显著上升,促使细胞内胞嘧啶脱氧核苷酸三磷酸（d CTP）和胸腺嘧啶脱氧核苷酸三磷酸（d TTP）大量合成。d ATP、d GTP、d CTP和d TTP的增加为DNA的合成提供了大量底物。此外,色氨酸代谢中的L-色氨酸、氨基酸生物合成中的L-色氨酸、L-酪氨酸和L-谷氨酸、硫胺素代谢中的L-酪氨酸、碳代谢以及乙醛酸和二羧酸酯代谢中的L-谷氨酸表达量全部显著上升。L-酪氨酸、L-谷氨酸和L-色氨酸三者可以通过脱氨基作用生成延胡索酸、乙酰Co A和α-酮戊二酸等物质,是丝腺细胞合成大量能量以及核酸的重要原料。这表明,let-7可能通过调控丝腺细胞核内DNA快速复制,进而促进了后部丝腺的生长发育。综上所述,通过蛋白质组学和代谢组学对let-7敲除后的后部丝腺进行分析,分别筛选到177个差异表达蛋白和97个差异表达代谢物;进一步,通过双荧光素酶酶活实验,鉴定了let-7在后部丝腺中的靶基因;最后,通过差异表达蛋白和差异代谢物代谢通路富集分析发现,let-7可能通过调控不同的代谢途径来调节五龄期幼虫后部丝腺细胞DNA的核内复制,进而促进了后部丝腺的生长发育。本研究进一步探索了丝腺生长发育和丝蛋白合成的关键分子机制,为通过遗传操作改良蚕丝提供了理论基础,并为进一步获得高丝量品种筛选了新的分子靶标。