稻瘟病菌中RNAi通用高效载体的构建

来源 :浙江大学农业与生物技术学院 浙江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lsydyn
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稻瘟病是一种毁灭性病害,给全世界的水稻生产带来巨大威胁,其病原菌为稻瘟病菌Magnaporthe oryzae。了解稻瘟病菌的致病机理不仅有利于稻瘟病的防治,而且作为研究植物病原真菌与寄主互作的理想模式,对于理解其它真菌的致病机理也有重要意义。细胞分裂是活细胞繁殖的过程。在多细胞生物中,细胞分裂是个体生长、发育和分化的基础。因此,研究细胞分裂相关基因具有重要意义。   RNA干涉(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发同源mRNA高效特异性降解的现象。目前,RNAi技术被广泛应用于基因功能的研究。对于致死基因的研究,RNAi技术显示独特的优势。   本文构建了RNAi高效载体并克隆了稻瘟病菌中的细胞分裂相关基因MoCDC45,通过RNAi分析了MoCDC45基因在稻瘟病菌致病性及其他相关过程的作用。具体研究结果如下:   (1)以水稻中进行光合作用暗反应的RUBP羧化酶因子mRNA的3-UTR中的一段序列作为发卡结构的两个臂,构建含有GFP的RNAi表达载体。   (2)通过荧光显微镜下荧光观察、RT-PCR、Southern杂交验证RNAi表达载体具有干涉的高效性,与对照菌株Guy11-GFP相比,其表达量下降约100倍。   (3)利用稻瘟病菌基因组序列,克隆了酵母CDC45在稻瘟病菌中的同源基因,定名MoCDC45。通过构建MoCDC45的RNAi表达载体和农杆菌转化,得到Δmocdc45 Knock-down突变子。挑选三个突变子进行分析。   (4)Δmocdc45突变子的菌落形态与野生型无明显差异。突变子与2539菌株交配,产生的子囊壳发生变化,育性受到影响。   (5)Δmocdc45突变子孢子萌发率和附着胞形成与野生型相比略减小。Δmocdc45突变子对大麦的致病力与野生型比没有太大变化,对水稻的致病力略下降。
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