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背景:表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）在具有活性EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者中提供显著的抗肿瘤活性。第三代EGFR-TKI奥希替尼（Osimertinib）是为了克服EGFR-TKI最常见的耐药机制T790M位突变而开发的,临床反应有效率为59%71%。但是随着时间的推移,作为第三代EGFR-TKI靶向抗肿瘤药物奥希替尼（Osimertinib）也不可避免的会产生耐药性,并且已经有文献报道了一些有关第三代EGFR-TKI耐药机制。尽管如此,目前为止我们对第三代EGFR-TKI获得性耐药机制并不完全了解,所以,高效快速的筛选出奥西替尼的潜在耐药基因,将会为第三代EGFR-TKI获得性耐药机制的进一步探明,新的靶向性药物的设计或是临床上联合使用靶向性药物治疗提供理论依据。目的:在非小细胞肺癌腺癌细胞NCI-H1975中筛选出奥希替尼的潜在耐药基因,并对筛选出的基因做进一步功能和机制的研究,为第三代EGFR-TKI获得性耐药机制的进一步阐明,提供理论依据。方法:利用CRISPR/Cas9全基因组文库质粒进行扩增并包装慢病毒,测试病毒滴度后感染NCL-H1975细胞（控制MOI≤0.3）,经嘌呤霉素抗性筛选后,使用奥西替尼继续筛选10代,收集存活的细胞,进行全基因组测序和生物信息学分析获得富集sgRNA所对应的候选基因。将候选基因从细胞中敲除,建立潜在耐药的细胞株,利用Western-blot检测敲除株的EGFR蛋白表达水平,以及c-PARP,EGFR下游的AKT,ERK等凋亡相关信号通路,同时利用CCK-8细胞生长实验和克隆形成实验来验证敲除候选基因细胞株对奥西替尼的耐药性影响。结果:在整个实验过程中,我们成功扩增出CRISPR/Cas9人类全基因组文库,A文库覆盖率为653%,B文库为408%,而我们感染目的细胞NCI-H1975的MOI值控制在0.255,我们将经过文库病毒感染及奥西替尼的筛选细胞测序分析后得到12个潜在的耐药基因,并在其中选择了FDX1基因进行功能鉴定,当在H1975细胞中敲除基因FDX1后,测序结果表明FDX1基因发生缺失,经Western blot检测FDX1的蛋白表达水平被明显抑制;50 nmol·L-1奥西替尼处理肿瘤细胞30 h,sg-AAVS1组细胞和sg-FDX1组细胞中c-PARP表达水平差异显著（P<0.01）;sg-FDX1组细胞相对于对照组sg-AAVS1细胞,减弱了奥西替尼对于p-EGFR、p-AKT及p-ERK信号活性的抑制作用（P<0.01）;克隆形成和CCK8实验表明,sg-FDX1组细胞相对于对照组sg-AAVS1细胞,奥西替尼对细胞克隆形成率和增殖活性抑制作用均显著降低（P<0.05）。结论:本研究成功建立了CRISPR/Cas9人全基因组文库筛选平台,并筛选出第三代EGFR-TKI药物奥西替尼的12个潜在耐药基因;并用筛选出的其中一个潜在耐药基因FDX1进行功能鉴定,发现在NCI-H1975细胞中敲除FDX1基因可能对NSCLC第三代靶向治疗药物奥西替尼挥作耐药作用。