论文部分内容阅读
背景与目的Ⅰ型干扰素包括IFN-α和IFN-β，是多功能的细胞因子，具有抗病毒，抗增殖，抗血管生成及免疫调节作用，许多研究已经证明，IFN-β能明显抑制多种肿瘤的生长。然而，IFN-β蛋白极短的半衰期是临床应用中的主要问题，而且，临床实验表明最大剂量给药后机体IFN-β血清浓度远远低于抗肿瘤效应所需要的有效药物浓度。由载体介导的基因治疗解决了这一难题。临床前研究已经表明，腺病毒（adenovirus，Ad）载体介导的IFN-β基因能在肿瘤细胞和组织局部高效表达，抑制这些肿瘤细胞或组织的生长，并能诱导其凋亡。所以，基因治疗是一种有前景的治疗手段，载体能够较容易的直接携带目的基因进入靶器官并潜在表达。腺病毒载体由于其短期表达的安全性，易于制备高滴度的病毒，转导效率较高等优点，已经在肿瘤基因治疗中得到广泛的应用。食管癌（esophageal carcinoma，EC）是人类常见的恶性肿瘤之一。全世界每年约有30万人死于食管癌，其中50％在我国，每年因食管癌死亡的人数约占我国全部恶性肿瘤死亡总数的1／4，严重危害人类健康。我们希望通过构建携带hIFN-β基因的重组腺病毒载体，研究AdhIFN-β对食管癌细胞体外增殖的影响，评价hIFN-β基因对食管癌细胞的抗增殖效应，为食管癌的基因治疗提供一定的理论基础和实验依据。材料和方法1．重组AdhIFN-β腺病毒载体感染HEK293细胞进行病毒扩增，经纯化后，用空斑形成实验法测定病毒滴度。2．分别用不同感染复数（multiplicity of infection，MOI）的AdGFP和AdhIFN-β感染KYSE150细胞，48h后在荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达。计算感染率。3．分别收集感染组和空白对照组细胞提取细胞总RNA。按试剂盒说明进行RT-PCR反应，测定AdhIFN-β在KYSE150细胞中的表达。从人基因组DNA扩增hIFN-β基因作为阳性对照。各组PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。4．收集感染组和空白对照组细胞，制备细胞涂片。按试剂盒说明进行免疫细胞化学染色，检测hIFN-β蛋白在细胞中的表达。5．取感染组及空白对照组细胞分别接种于6孔板中，2w后倒置相差显微镜下观察细胞克隆形成情况。计算克隆形成率。6．KYSE150细胞接种于96孔培养板，分别用AdGFP和AdhIFN-β感染细胞，并以未加病毒的KYSE150细胞作为对照组，MTT法测定KYSE150细胞的体外增殖能力。7．AdGFP和AdhIFN-β感染KYSE150细胞，3d后收集细胞，70％乙醇4℃固定过夜，加入RNA酶A（终浓度50ug／ml），37℃作用1h，再用碘化丙啶（终浓度100ug／ml）室温避光染色30min，流式细胞仪检测细胞周期。8．常规方法提取感染组和对照组细胞DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外透射仪下观察凋亡细胞梯形条带的形成。9．统计学处理：采用SPSS10.0统计分析软件包分析，数据以均数±标准差（（?）±s）表示，差异的显著性比较采用t检验，检验标准：α=0.05。结果重组腺病毒AdhIFN-β经HEK293细胞扩增、纯化后滴度可达2×1011pfu／ml，且30MOI的病毒可使95％以上的KYSE150细胞感染；RT-PCR、免疫细胞化学法分析表明，外源性hIFN-β基因在KYSE150细胞获得明显表达；MTT实验和集落形成能力实验表明，与对照组相比，AdhIFN-β感染后细胞生长受到明显抑制；流式细胞仪检测显示细胞S期延长；DNA片断化分析显示细胞发生了凋亡。结论AdhIFN-β感染的转基因肿瘤细胞可表达hIFN-β，并明显抑制食管癌细胞的生长，使细胞S期延长并能诱导其凋亡，为该基因应用于食管癌的基因治疗提供了理论基础。