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在大肠杆菌(Escherichia coli)中,重组蛋白的分泌表达与胞内表达相比,具有以下优势。第一,细胞周质空间提供了氧化环境,有利于重组蛋白二硫键的正确形成;第二,周质空间中的蛋白酶活性低,有利于重组蛋白稳定有在;第三,胞外分泌表达能增强某些基因产物的可溶性;第四,分泌表达有利于重组蛋白的纯化。因此,近年来重组蛋白在大肠杆菌中的分泌表达已成为重要的发展方向与策略之一。
本研究选择不同类型蛋白质将其编码基因连接到大肠杆菌分泌蛋白Y基因的3’端,构建了系列分泌表达载体,利用pET载体在大肠杆菌BL21(DE3)中重组蛋白的过量表达分析,发现重组蛋白的表达出现三种不同的状况:顺利完成胞外分泌表达;表达产物主要在细胞内积累分泌效率低;表达异常,表现为表达产物在胞内和周质中均无显著积累。
本研究对重组蛋白的表达异常进行了初步分析。mRNA结构异常或不稳定可能是导致蛋白表达异常的原因之一,通过构建重组蛋白mRNA结构相似的系列表达载体(pET30a-Sp-Y-EGFP、pET30a-Y-EGFP、pET30a-Sp-Y-TAA-EGFP;pET30a-Sp-Y-Sufl、pET30a-Y-Sufl、pET30a-Sp-Y-TAA-Sufl),分析重组蛋白的分泌表达,发现Y-EGFP蛋白可在细胞内正常积累,载体pET30a-Sp-Y-TAA-EGFP的Y蛋白可正常分泌到周质,初步表明mRNA结构并非是造成重组蛋白表达异常的主要因素。
大肠杆菌细胞内蛋白酶可能是导致分泌蛋白表达异常的另一个因素。本研究敲除了以较大异常蛋白为底物的ClpP,HslUV蛋白酶基因,构建了蛋白酶基因缺失突变株。重组蛋白的分泌表达研究发现,其在突变株与对照菌株的表达情况相似,初步证明了分泌蛋白的表达异常也并非由细胞质蛋白酶降解导致,原因有待进一步研究。
本研究还通过在可分泌蛋白ACP的末端添加不同长度及性质的氨基酸探索其对分泌效率的影响,发现在可分泌蛋白末端添加亲水氨基酸对其分泌影响很小,但添加疏水性氨基酸对其分泌影响较大,添加疏水性较强的异亮氨酸数目超过6时,SDS-PAGE难以检测到目的蛋白的显著积累。