第一部分木犀草素通过抑制自噬来增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性背景和目的卵巢癌(Ovarian cancer)起病隐匿、缺乏早期临床症状,是所有妇科恶性肿瘤中死亡率最高的一种。目前肿瘤细胞减灭手术联合顺铂为主的化疗是治疗卵巢癌的主要手段,但复发率高、预后差。化疗耐药是卵巢癌预后差的主要原因。木犀草素是一种天然四羟基黄酮类化合物,在自然界中分布广泛。前人研究显示,高浓度木犀草素能抑制多种肿瘤细胞的增殖和转移,低浓度的木犀草素虽然对肿瘤毒性小,但可以增强多种恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。卵巢癌中,木犀草素能抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭。但木犀草素对卵巢癌细胞化疗敏感性方面的影响以及相关机制的研究还未见报道。凋亡是通过细胞内的遗传机制使细胞有序的走向死亡,最终整个细胞被消化降解。凋亡的意义是清除老化、受损或突变的细胞,保护个体的健康。自噬是机体应对应激的一种重要的生存机制,能够清理胞内受损或非功能性的蛋白质及细胞器,使细胞继续生存下去,具有保护细胞的作用。目前的研究证实自噬在多种肿瘤细胞对抗癌药的反应中发挥重要的作用。微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II是自噬的标志物,自噬被诱发后,LC3-II的表达增加。阐明自噬的机制或许能为肿瘤的治疗提供更有效的策略。本研究旨在探索木犀草素能否影响SKOV3细胞对顺铂敏感性,并初步揭示该过程的作用机理。方法1、不同浓度的木犀草素(浓度梯度为0、5、10、20、40、80和160 μM)单独作用于SKOV3细胞,CCK-8实验确定木犀草素的IC50值。0μM、20μM和40 μ的木犀草素分别作用于不同浓度的顺铂中(浓度梯度为0、5、10、20、40和80 μM),24 h后CCK-8实验检测各组细胞活力并算得每个浓度木犀草素作用下顺铂的IC50值。2、流式细胞术和Western blot检测木犀草素联合顺铂作用后SKOV3细胞凋亡率和caspase-3的表达。3、电镜、免疫荧光和Western blot实验分别观察木犀草素联合顺铂作用后SKOV3细胞自噬小体和LC3-II的表达情况。结果1、高浓度木犀草素才能达到抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的目的。木犀草素的IC50值为65 μM,所以选择IC50以下的20μM 和40 μM的木犀草素与不同浓度的顺铂联合作用对比抑制效果是否存在差异。进一步研究发现,与顺铂单独处理的SKOV3细胞(顺铂IC50=21 μM)相比,20 μ或40 μM木犀草素联合顺铂处理的SKOV3细胞增殖能力明显降低(顺铂IC50分别为14 μM和10μM)。因此,本研究选择40 μ木犀草素和对应的10 μ顺铂进行后续研究。2、与对照组相比,木犀草素单独作用的SKOV3细胞凋亡率变化不显著,而顺铂单独作用的SKOV3细胞凋亡率显著升高。与顺铂单独作用组相比,木犀草素联合顺铂共同作用的SKOV3细胞的凋亡率升高2.25倍(p<0.001)。类似的,木犀草素单独作用的SKOV3细胞内caspase-3的表达较对照组没有差异。顺铂单独作用的SKOV3细胞内caspase-3的表达较对照组显著升高,而木犀草素联合顺铂共同作用的SKOV3细胞内caspase-3的表达高于顺铂单独作用组2.15倍(p<0.001)。3、电镜结果显示,顺铂作用后SKOV3细胞内自噬小体数量明显增加,而木犀草素联合顺铂作用后SKOV3细胞内自噬小体数量大量减少。相应的,免疫荧光和Western blot结果显示,顺铂单独作用的SKOV3细胞LC3-II的表达较对照组显著上调,而木犀草素联合顺铂作用的SKOV3细胞LC3-II的表达较顺铂单独作用时下调了 3.16倍(p<0.001)。结论1、木犀草素对SKOV3细胞毒性小,但它能够强化顺铂抑制SKOV3细胞增殖的效果。2、木犀草素不影响SKOV3细胞凋亡,但它能够强化顺铂诱导SKOV3细胞凋亡的效果。3、木犀草素通过抑制自噬来增强SKOV3细胞对顺铂的敏感性。综上所述,本研究初步揭示了木犀草素增强卵巢癌细胞化疗敏感性的原理。木犀草素通过抑制自噬来增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,使低浓度的顺铂便能有效抑制SKOV3细胞生存。因此,木犀草素有望成为理想的卵巢癌化疗增敏药物。第二部分木犀草素通过降低PARP1的表达抑制自噬来增强卵巢癌细胞的化疗敏感性背景和目的PARP1是核酶家族PARPs中的一员,它能通过碱基切除修复来修复损伤DNA、维持基因组的完整性。临床研究显示,PARP1在多种恶性肿瘤中表达上调,体外研究显示,PARP-1缺失的小鼠对基因毒性药物刺激的敏感性增加。且有研究证实PARP抑制剂能够通过作用于诸如鼻咽癌细胞等不同类型的肿瘤细胞的自噬过程增敏化疗,调节细胞的增殖与凋亡。另外有报道PARP-1抑制物可以在不降低治疗效果的情况下降低顺铂的使用浓度,进而进一步降低副反应。此外,PARP-1在哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬通路中发挥作用。根据前文的研究结果,木犀草素通过抑制自噬来增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。推测木犀草素可能通过抑制PARP1来抑制卵巢癌细胞自噬。因此,本研究检测木犀草素联合顺铂作用的卵巢癌细胞中PARP1的表达后,通过沉默和过表达PARP1两种方案进一步明确在促进化疗敏感性过程中木犀草素抑制卵巢癌细胞自噬的分子机制。方法1、实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测木犀草素(0、10、20和40μM)作用不同时间(0、12、24和48h)后SKOV3细胞PARP1的表达,以及木犀草素联合顺铂作用下SKOV3细胞PARP1的表达。2、RNAi沉默PARP1后,CCK-8、流式细胞术和Western blot实验观察木犀草素联合顺铂作用下SKOV3细胞增殖和凋亡的变化。3、RNAi沉默PARP1后,Western blot和免疫荧光实验观察木犀草素联合顺铂作用下SKOV3细胞自噬的变化。4、过表达PARP1后,CCK-8、流式细胞术和Western blot实验观察木犀草素联合顺铂作用下SKOV3细胞增殖和凋亡的变化。5、过表达PARP1后,Western blot和免疫荧光实验观察木犀草素联合顺铂作用下SKOV3细胞自噬的变化。结果1、木犀草素能以剂量依赖性和时间依赖性的方式显著抑制PARP1 mRNA和蛋白质的表达(p<0.01)。顺铂能显著增加PARP1的表达,而木犀草素联合顺铂作用后,SKOV3细胞内PARP1的mRNA水平和蛋白水平较顺铂单独作用时分别下降2.69倍和2.44倍(p<0.001)2、CCK-8实验发现顺铂单独作用于siPARP1的SKOV3细胞与木犀草素联合顺铂作用于正常SKOV3细胞均能剂量依赖性的显著抑制细胞增殖,并且顺铂的IC50值十分接近,均约为10 μM左右,而木犀草素联合顺铂作用于siPARP1的SKOV3细胞时顺铂的IC50值仅为5μM。因此,本研究选择5μM顺铂用于后续实验。流式细胞术结果显示,沉默PARP1后,木犀草素联合顺铂作用的SKOV3细胞凋亡率较沉默前升高1.3倍(p<0.001)。类似的,同样的木犀草素联合顺铂作用,沉默PARP1后SKOV3细胞caspase-3的表达比沉默前显著上调(p<0.001)。3、同样的木犀草素联合顺铂作用,沉默PARP1后SKOV3细胞的LC3-Ⅱ的表达量比沉默前下降了 9倍(p<0.001)。4、CCK-8实验发现木犀草素联合顺铂作用于正常SKOV3细胞时,顺铂的IC50为8μM,而木犀草素联合顺铂作用于过表达PARP1的SKOV3细胞时顺铂的IC50值增加至20 μM。因此,本研究选择最小IC50以下的5 μM顺铂用于后续实验。流式细胞术结果显示,木犀草素联合顺铂的SKOV3细胞凋亡率比顺铂单独作用的NC组高出1.7倍;而在此基础上过表达PARP1后SKOV3细胞的凋亡率降低了 1.4倍,与NC组没有差异(p<0.001)。类似的,与NC组相比,木犀草素联合顺铂的SKOV3细胞caspase-3表达显著升高,而过表达PARP1后caspase-3的表达显著下调(p<0.01)。5、与NC组相比,木犀草素联合顺铂作用于SKOV3细胞能够显著下调LC3-Ⅱ的表达,而在此基础上过表达PARP1能显著上调LC3-Ⅱ的表达。结论1、在木犀草素提升SKOV3细胞化疗敏感性过程中PARP1表达降低。2、沉默PARP1协同木犀草素进一步提升卵巢癌细胞化疗敏感性。3、沉默PARP1协同木犀草素进一步降低卵巢癌细胞自噬。4、过表达PARP1逆转木犀草素提升的卵巢癌细胞化疗敏感性。5、过表达PARP1逆转木犀草素抑制的卵巢癌细胞自噬。综上所述,本研究明确了木犀草素通过降低PARP1的表达来抑制卵巢癌细胞自噬,进而增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。揭示了木犀草素增强卵巢癌细胞化疗敏感性的机制。因此,木犀草素有望成为治疗卵巢癌化疗耐药的有效药物,延迟患者的生存期限。