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研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性的神经退行性疾病,临床主要表现为学习记忆和认知功能障碍。AD主要病理特征为β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)在细胞外沉积形成的老年斑和过度磷酸化的tau蛋白形成的神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs),目前尚无有效的方法能够治疗AD。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能的成体干细胞,在治疗AD方面具有较大的潜能。经血间充质干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)是一种从女性月经血中提取的间充质干细胞,获取方便,并且无伦理方面的困扰。MenSCs现已经用于宫腔粘连、脊髓损伤以及帕金森病等多种疾病的治疗,但是目前尚未发现MenSCs在AD方面的应用。在本研究中,我们将APP/PS1转基因小鼠作为AD模型,双侧海马移植MenSCs,检测了 MenSCs对APP/PS1转基因小鼠行为学、Aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化和小胶质细胞的影响,从而研究MenSCs对AD的治疗作用。研究方法1.我们通过流式细胞技术对MenSCs进行了鉴定,检测其表面标志物的表达。将7月龄APP/PS1转基因小鼠随机分为MenSC组和PBS组,MenSC组小鼠双侧海马移植3μl MenSCs悬液(约1×105个细胞),PBS组注射等量PBS。3周后将各组小鼠进行新物体识别实验与Morris水迷宫实验,检测MenSCs对APP/PS1转基因小鼠学习记忆功能的影响。2.新物体识别实验与Morris水迷宫实验结束后,我们通过MAB1281染色检测了 MenSCs在APP/PS1转基因小鼠脑内的分布情况。运用免疫荧光染色与ELISA法检测了 MenSCs对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响。为了探究MenSCs对Aβ沉积影响的潜在作用机制,我们通过Western blot检测了 APP蛋白淀粉样途径中BACE1与β-CTF蛋白表达的变化。3.为了研究MenSCs对小胶质细胞的作用,我们通过免疫荧光染色检测了APP/PS1转基因小鼠海马与皮层中Iba-1的表达,并运用qRT-PCR检测了 M1表型小胶质细胞相关的炎症因子与M2表型小胶质细胞标志物的表达,还通过Western blot 检测了 Aβ 降解酶胰岛素降解酶(Insulin-degrading enzyme,IDE)和脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)的蛋白表达。4.我们通过Western blot检测了 MenSCs对APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化的影响,为了进一步阐明MenSCs对tau蛋白磷酸化影响的潜在作用机制,我们还检测了 GSK-3β的表达水平及其上游信号调控分子PI3K/Akt信号通路的变化。5.为了研究MenSCs对突触相关蛋白的影响,我们通过Western blot检测了APP/PS1转基因小鼠海马与皮层中突触素(Synaptophysin,SYP)、突触蛋白1(Synapsin 1,SYN-1)以及突触后密度蛋白 95(Postsynaptic density protein 95,PSD95)的表达。研究结果1.MenSCs 呈梭状,表达 CD29,CD73,CD90,CD105,不表达 CD34,CD45,CD117和HLA-DR分子,符合国际细胞治疗学会建议的间充质干细胞的标准。在新物体识别实验中,MenSC组小鼠认知指数明显高于PBS组小鼠;在Morris水迷宫实验中,MenSC组小鼠逃避潜伏期时间明显少于PBS组小鼠,且在60s内穿越原平台所在位置的次数明显高于PBS组小鼠,提示移植MenSCs后能改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍。2.MAB1281染色结果显示MenSCs分布在APP/PS1小鼠的海马与皮层中,而其他部位并未发现MenSCs。硫磺素S与6E10染色结果显示移植MenSCs后显著降低了 APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积;ELISA结果表明MenSC组小鼠海马与皮层中Aβ40和Aβ42水平显著降低;Western blot结果表明MenSC组小鼠海马与皮层中BACE1和β-CTF蛋白表达显著降低,提示MenSCs可能通过抑制APP蛋白的淀粉样途径,即通过抑制Aβ产生来减少Aβ沉积。3.Iba-l染色结果显示移植MenSCs后能促进APP/PS1转基因小鼠海马与皮层中小胶质细胞的活化;qRT-PCR结果显示MenSC组小鼠海马与皮层中多种炎症因子的表达显著降低,M2表型小胶质细胞标志物的表达显著增加,且NEP与IDE的表达也显著增加,提示移植MenSCs后能促进小胶质细胞的活化并诱导活化的小胶质向M2表型转化,从而促进NEP与IDE的表达,减少Aβ的沉积。4.移植MenSCs后能显著降低APP/PS1转基因小鼠海马与皮层中tau蛋白Ser202/Thr205、Thr231、S396 和 S404 位点的磷酸化水平,Western blot 结果显示MenSCs能够激活GSK-3β Ser9位点磷酸化,抑制GSK-3β活性,且MenSCs能够激活GSK-3β上游调控分子PI3K/Akt信号通路,上述结果表明MenSCs减少tau蛋白过度磷酸化的作用可能是通过激活PI3K/Akt信号通路从而抑制GSK-3β活性来实现的。5.Western blot结果显示移植MenSCs后能够显著增加APP/PS1转基因小鼠海马与皮层中突触相关蛋白SYN-1、SYP和PSD95的表达。结论移植MenSCs能明显改善APP/PS1转基因小鼠的认知功能,这可能与增加突触相关蛋白SYP、SYN-1、PSD95的表达有关。MenSCs能够减少APP/PS1小鼠脑内Aβ的沉积,这种减少作用可能是通过抑制BACE1的活性和促进小胶质细胞分泌NEP与IDE来实现的。MenSCs还能促进APP/PS1转基因小鼠海马与皮层中小胶质细胞的活化,并诱导活化的小胶质细胞向M2表型转化,抑制神经炎症。MenSCs也能显著抑制APP/PS1小鼠海马与皮层中tau蛋白的过度磷酸化,且其抑制tau蛋白过度磷酸化的作用可能是通过激活PI3K/Akt信号通路,从而抑制GSK-3β活性来实现的。我们的研究在一定程度上为MenSCs治疗AD提供了理论基础,也为临床治疗AD提供了新的思路与方法。