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研究目的:异叶青兰(Dracocephalum heterophyllum,DH)是用于治疗肝炎、心肌肥大、高血压等疾病的中草药,能够抑制炎症细胞因子产生,葡萄膜炎是一类主要由CD4~+T细胞介导的自身免疫性疾病,我们前期的研究发现异叶青兰提取物在体外能显著抑制CD4~+T细胞的增殖,因此我们开展本实验,目的在于研究异叶青兰对CD4~+T细胞功能的影响及对自身免疫性葡萄膜炎是否有治疗作用和其机制,从而为包括自身免疫性葡萄膜炎在内的自身免疫性疾病的防治提供新的思路。研究方法:(1)异叶青兰提取物的制备:用乙醇和乙酸乙酯制备异叶青兰提取物,通过真空冷冻干燥机制成干粉备用。(2)从正常小鼠的肠系膜淋巴结中分离得到CD4~+T细胞,用不同浓度的异叶青兰提取物(10、20、40mg/L)进行处理,对照组不加提取物,48h后收集上清,通过ELISA法测定异叶青兰提取物对CD4~+T细胞产生细胞因子的影响。(3)从正常小鼠的肠系膜淋巴结中分离得到CD4~+T细胞,用不同浓度的异叶青兰提取物(10、20、40mg/L)进行处理,对照组不加提取物,48h后对细胞进行染色,通过流式细胞仪检测异叶青兰提取物对CD4~+T细胞产生细胞因子能力的影响。(4)从正常小鼠的肠系膜淋巴结中分离得到CD4~+T细胞,一部分CD4~+T细胞用不同浓度的异叶青兰提取物(10、20、40mg/L)进行处理,对照组不加提取物,48h后对细胞进行计数及Annexin-Ⅴ/PI染色,研究异叶青兰提取物在体外对CD4~+T细胞凋亡的影响,另一部分CD4~+T细胞用CFSE染料进行标记,培养72h后用流式细胞仪检测异叶青兰提取物在体外对CD4~+T细胞增殖的影响。(5)将6-8周大的正常小鼠分为两组,DH组尾静脉注射20mg/kg的异叶青兰提取物,DMSO组注射相同剂量的DMSO,12h后向小鼠腹膜内注射BrdU,连续给药3天,将DMSO组和DH组小鼠的PP(派尔集合淋巴结)、iEC(肠上皮细胞)、LP(固有层细胞)进行染色,通过流式细胞仪测定CD4~+BrdU~+T细胞数目和CD4~+T细胞数目,研究异叶青兰提取物在体内对CD4~+T细胞增殖的影响。(6)诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞,从Foxp3-YFP转基因小鼠中分离Treg细胞,用不同浓度的异叶青兰提取物(10、20、40mg/L)进行处理,对照组不加提取物,48h后计数总细胞数,收集上清液,用ELISA法测定上清液中细胞因子的浓度,研究异叶青兰对其他类型免疫细胞增殖和产生细胞因子的影响。(7)构建小鼠EAU模型,DH组尾静脉注射20mg/kg的异叶青兰提取物,DMSO组注射相同剂量的DMSO,不处理的为对照组。对小鼠眼球病理切片进行HE染色评分,分离小鼠眼球总细胞进行培养,收集上清液,通过ELISA法检测上清液中细胞因子浓度。研究异叶青兰能否预防或减轻自身免疫性葡萄膜炎。(8)从诱导EAU的DH、DMSO和对照组小鼠的眼睛中分离总细胞,通过流式细胞术检测小鼠眼球中CD4~+T细胞及凋亡CD4~+T细胞的数目及百分比,研究异叶青兰提取物对小鼠眼睛中CD4~+T细胞增殖和凋亡的影响。(9)从诱导EAU的DH、DMSO和对照组小鼠的颈部淋巴结(Cervical lymph nodes,CLN)中分离总细胞,通过流式细胞术检测小鼠眼球中CD4~+T细胞数目及百分比,研究异叶青兰提取物对小鼠CLN中CD4~+T细胞增殖的影响。(10)从诱导EAU的DH、DMSO和对照组小鼠的眼睛中分离总细胞,通过流式细胞术检测小鼠眼球中MDSC细胞的百分比,研究异叶青兰提取物对小鼠眼睛中MDSC细胞数目的影响。结果:(1)CD4~+T产生的炎症因子随着异叶青兰提取物浓度的增加而减少,(P<0.01),差异有统计学意义。(2)CD4~+T细胞产生促炎细胞因子的能力不随异叶青兰提取物浓度改变,差异无统计学意义。(3)小鼠的CD4~+T细胞的数目在体外随着异叶青兰提取物浓度的增加而减少,(P<0.01),差异有统计学意义,CD4~+T细胞的凋亡在组间无明显差别,差异无统计学意义。(4)在体内,DH组小鼠的PP、iEC、LP中CD4~+T细胞的增殖明显少于DMSO组(P<0.05),差异有统计学意义。(5)DH组和DMSO组中BMDC、BMDM和Treg的细胞数量及细胞因子的表达无明显差别,差异无统计学意义。(6)DH组小鼠EAU发病程度低于DMSO组(P<0.01),差异有统计学意义。(7)DH组小鼠眼中CD4~+T细胞的数目少于DMSO组(P<0.01),差异有统计学意义,凋亡CD4~+T细胞的数目未见明显改变,差异无统计学意义。(8)DH组小鼠CLN中CD4~+T细胞的数目较对照组小鼠增加,与DMSO组无明显差别,差异无统计学意义。(9)DH组小鼠眼中MDCS细胞的百分比与DMSO组相比未见明显增加,差异无统计学意义。结论:(1)异叶青兰提取物在体外抑制CD4~+T细胞增殖从而降低炎症因子水平,不影响CD4~+T细胞的凋亡。(2)异叶青兰提取物在体内同样抑制CD4~+T细胞的增殖。(3)异叶青兰提取物不影响其他类型免疫细胞的增殖和细胞因子表达。(4)异叶青兰提取物可明显改善小鼠EAU发病程度,其机制是通过抑制CD4~+T细胞增殖降低炎症因子水平,同时不影响细胞凋亡及眼内MDSC细胞数量。