大鼠脂肪来源干细胞的分离、培养及不同诱导液对其细胞状态的影响

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目的:探索不同过滤方法及不同血清条件对大鼠脂肪来源干细胞生长状态的影响并评估两种不同诱导培养液对其增殖活性的影响。   方法:取出生4d SD乳鼠腹股沟脂肪组织,I型胶原酶消化法分离脂肪来源干细胞:(1)不经过滤、经80目不锈钢细胞筛过滤、经200目不锈钢细胞筛过滤处理,分别收集、接种细胞并培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况。(2)分别采用新生牛血清和胎牛血清培养脂肪来源干细胞,观察两种血清培养条件下的细胞状态。(3)分别用牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)和含200μg/ml牙本质非胶原蛋白(DNCP)的D/F12培养液(DNCPM)诱导培养P2代脂肪来源干细胞,观察细胞形态的变化,诱导3d后分别以MTT法、AnnexinⅤ/PI双染流式检测法检测细胞增殖及胞凋亡情况。   结果:(1)未经过滤组脂肪细胞及杂质细胞多;80目筛网过滤组,镜下仍可见胶质样组织块;200目筛网过滤组未见组织块及杂质细胞,细胞形态均一。(2)新生牛血清培养的原代脂肪来源干细胞多呈短梭状,胎牛血清培养的原代脂肪来源干细胞多呈小多角形;前者培养的细胞在P2~P3代出现衰老趋势。(3)TGC-CM组及DNCPM组培养6d后细胞形态均发生极性改变,但DNCPM组贴壁细胞数明显减少;TGC-CM组与对照组OD值差异不具有统计学意义(P>0.05),而DNCPM组OD值显著低于对照组及TGC-CM组(P<0.01);DNCPM组细胞凋亡率高于TGC-CM组(P<0.05)。   结论:(1)200目不锈钢细胞筛过滤的原代脂肪来源干细胞杂质少,细胞形态好。(2)新生牛血清较胎牛血清培养的脂肪来源干细胞形态有差异;新生牛血清培养的脂肪来源干细胞活力低,不利于实验的后续研究。(3)TGC-CM用于诱导脂肪来源干细胞对细胞活性影响小;DNCP作为诱导剂可能影响细胞的增殖且使细胞的凋亡率增高。(4)TGC-CM可能是较好的诱导脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化的诱导条件。
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