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目的:对非综合征型牙齿先天缺失患者行全外显子测序分析,寻找可能的遗传病因,并通过后期实验研究其分子通路机制,探讨突变基因的致病机理,为非综合征型牙齿先天缺失疾病的深入研究打下理论基础。方法:1、病例收集及数据分析对天津某高校4002名在校学生进行口腔检查,详细记录数据并利用卡方检验进行统计学分析,统计先天缺牙和牙齿畸形的患病率,分析疾病的患病特点。对于确诊为非综合征型牙齿先天缺失的患者,在取得天津医科大学口腔医学院伦理委员会同意及患者签署知情同意书情况下进行采血,取患者外周血4ml于-80摄氏度条件下临时保存。2、牙齿先天缺失患者样本的全外显子测序及验证采用Agilent的液相芯片捕获系统并建库,对于入选的患者进行全外显子测序,突变的基因利用Phenolyzer软件进行分析,根据基因和疾病相关性排序,排名前10位的行进一步分析。对比1000人基因组计划所有数据,突变碱基小于0.01频率的记录为有意义突变。有意义突变基因将进行一代测序进一步验证。3、基因突变位点的多种生物信息软件预测利用MutationTaster、CADD、dbNSFP、SIFT等多种生物信息软件对致病基因突变位点进行预测分析,利用Protean(Lasergene)软件在已知的野生蛋白结构基础上,对新发突变蛋白进行二级结构预测。4、人外周静脉血细胞中PAX9基因新发突变的功能分析利用TRIZOL抽提患者外周血细胞中RNA,反转录后定量PCR测定PAX9基因表达及PAX9下游基因BMP4的表达。5、致病基因新发突变的体外细胞功能分析正常及突变基因探针pIRES2-EGFP-PAX9、pIRES2-EGFP-PAX9MUT测序验证后瞬时转染NIH3T3细胞系,转染24小时及48小时后TRIZOL收样。提取RNA并反转录,随后进行定量PCR检测细胞中PAX9的表达水平。双荧光素酶实验报告探针pGL3-PAX9(由pGL3-BASIC和BMP4 promoter共同构建形成)与pRL-TK Renilla荧光素酶对照探针和pIRES2-EGFP-PAX9或pIRES2-EGFP-PAX9MUT共转染,检测荧光素酶活性。结果:1、本调查人群牙齿先天缺失的患病率3.92%,下颌患病率(2.77%)高于上颌(1.50%),女性患病率(4.51%)高于男性(2.87%),差异有统计学意义(χ~2=4.40P=0.04;χ~2=6.49 P=0.01);牙齿畸形患病率4.87%,上颌(4.05%)比下颌(0.93%)好发,汉族患病率(5.16%)高于少数民族(2.85%),差异有统计学意义(χ~2=43.60P=0.00;χ~2=4.92 P=0.03)。牙齿先天缺失多见于下颌侧切牙,牙齿畸形多见于上颌侧切牙。多数患者牙齿先天缺失及牙齿畸形的数目为1-2颗。2、全外显子测序发现一散发病例PAX9上的新发错义突变和一已报道SNP,一代测序进一步验证,证实PAX9基因上新发突变(c.G1057A p.V111M)和已报道SNP(c.G1444C p.A240P)的存在。3、SIFT及MutationTaster均显示PAX9上新发突变(c.G1057A p.V111M)为致病突变;CADD显示其为有害突变;dbNSFP软件显示该突变位点在保守区域。Protean显示突变PAX9蛋白位于111位氨基酸附近的β区域较野生型PAX9蛋白截短。4、研究结果显示PAX9基因表达在该病例外周血中较正常对照高,BMP4基因表达较正常对照表达低。5、细胞功能实验显示突变的PAX9较正常PAX9表达升高,变异PAX9蛋白对下游BMP4启动子的转录激活能力低于正常PAX9蛋白。结论:1、流行病学调查显示天津某高校学生先天缺牙和牙齿畸形患病率分别为3.92%和4.87%,两种疾病患病率较高且各有患病特征,需引起临床医生的高度重视。2、对部分先天缺牙患者行全外显子测序发现一散发非综合征型先天缺牙患者PAX9上新发错义突变(c.G1057A p.V111M)。该突变通过改变PAX9正常结构和表达,影响下游基因BMP4启动子反式激活的能力,下调其下游基因BMP4的表达,可能是该患者缺牙表现的遗传学病因。本次研究结果扩展了PAX9基因突变图谱,验证了PAX9及BMP4间的关系。