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仔猪是现代化养猪生产的核心,其健康状况对后期的生长发育产生极其重要的影响。现代养殖中,为提高效益仔猪实行早期断奶。断奶后,食物由母乳变为饲料,再加上环境的改变,加剧断奶应激。导致仔猪免疫力下降,腹泻率及死亡率升高,给养殖业带来巨大的损失。为减少这一风险,在过去的50多年里,抗生素作为生长促进因子被大量用于畜禽养殖业,为养殖业做出了巨大贡献。但是,抗生素的长期大量使用,破坏了机体的微生态平衡,导致耐药菌的产生和细菌的变异,并容易造成动物内源性感染或二次感染,同时,肉制品中的药物残留时有发生,直接威胁人类的健康。因此,寻找无毒无害无残留抗生素替代品迫在眉睫。在众多潜在的替代品中,益生菌以其独特的益生理念而备受推崇。本文以断奶仔猪为研究对象,研究了不同剂量的枯草芽孢杆菌,粪肠球菌,丁酸梭菌和凝结芽孢杆菌对仔猪生产性能、腹泻率、血液生化指标及粪便菌群的影响。随后,以此为基础,组成复合制剂,评价其对断奶仔猪生长的影响。在技术手段上,采用分子生物学技术,变性梯度凝胶电泳(DGGE)和实时荧光定量PCR (Real-timePCR),结合微生物分子生态学方法研究益生菌对粪便菌群结构组成的影响。(1) Bacillus subtilis KN-42360头仔猪(断奶日龄26+2d,平均体重7.14±0.63kg),按照体重和性别随机分成20栏(18头／栏；公：母=1：1),按照完全随机设计,分成5个处理组：阴性对照组(简称NC；无抗生素无益生菌),阳性对照组(PC；每kg日粮中添加100mg的硫酸新霉素)；益生菌组(低、中、高3个剂量水平,简称L,M和H,每kg饲料中分别添加2×109,4×109和20×109CFU的B. subtilis K-42)。根据基础日粮的不同,实验分成2个阶段(Ⅰ：d1to14和Ⅱ：d15to28)。结果表明,整个实验期,与组NC相比,组PC、M和H在日增重(ADG)和肉料比(G/F)上显著提高(P<0.05),组PC,组L,M和H的腹泻率显著降低(P<0.05)；第28d采集新鲜的粪便样品,采用DGGE和Real-time进行分析。DGGE分析表明B. subtilisKN-42改变了的粪便的细菌群落结构,组M的细菌多样性指数和条带数高于其它4个组；1Real-time PCR分析表明,与组NC相比,组PC和H的Lactobacillus的相对数量显著升高(P<0.05),而E. coli的相对数量显著减少(P<0.05)。(2) Enterococcus faecalis LAB31360头仔猪(断奶日龄26±2d,平均体重7.66±0.54kg),按照随机区组设计分成5个处理组：阴性对照组(简称NC),阳性对照组(PC;每kg日粮中添加100mg的硫酸新霉素)；益生菌组每kg饲料中分别添加0.5×109,1.0×109,2.5×109CFU的Enterococcus faecalis LAB31,简称L,M和H)。整个实验期,与NC相比,益生菌组L、M、H和组PC在ADG和G/F上显著提高(P<0.05)；腹泻率组NC显著高于其它4组,组L显著高于组H(P<0.05)。第27d,每组采集5份血液样品,分析表明白细胞,红细胞和血红蛋白浓度以及淋巴细胞的比例,各组之间均无显著差异(P>0.05)。第28d采集粪便样品。DGGE及多样性分析表明,组NC条带及Shannon index H’最低,与组L和H相比,中剂量M更有利于细菌的多样性。Real-time PCR分析表明,组PC和H在Lactobacillus相对含量上高于组NC和组L(P<0.05)。而类群DGGE分析表明,Lactobacillus组成稳定。(3) Clostridium butyricum B1360头仔猪(断奶日龄26±2d,平均体重6.91±0.55kg),按照完全随机区组设计,分成5个处理组：阴性对照组(简称NC),阳性对照组(PC；每kg日粮中添加(?)0mg的硫酸新霉素和75mg的喹烯酮)；益生菌组(每kg饲料中分别添加0.5×108,1×108和5×108CFU的C. butyricum Bl,简称L,M和H)。结果表明,整个实验阶段(d1to28),抗生素组PC和益生菌组L在ADG和G/F上显著高于阴性对照组,组PC和组L、M和H腹泻率显著低于NC,组M腹泻率最低。第27d,白细胞,血红蛋白,血小板,平均血红蛋白浓度和淋巴细胞的浓度及比例,在各组之间均无显著差异(P>0.05)。然而,对于红细胞的浓度,组H显著高于组L。分别于第14d和28d采集粪便样品,进行DGGE分析,点样时,每组4个重复,结果表明,总细菌及Lactobacillus群落个体间差异较大,梭菌占总细菌的比例最高,Lactobacillus以L. reuteri频率最高。(4) Bacillus coagulans F5实验Ⅰ：120头仔猪,断奶日龄28±2d,平均体重8.01±0.64kg,按照完全随机设计,分成4个处理：阳性对照组(PC；每kg日粮中添加80mg的金霉素)；益生菌组(每kg饲料中分别添加0.5×108,2.5×108和12.5×108CFU的B. coagulans F5,分别简称L,M和H,)。饲喂14d后,分析表明高剂量组H在ADG和G/F上显著高于低剂量组L(P<0.05),腹泻率上各组之间无显著差异(P>0.05)。实验Ⅱ：360头仔猪(断奶日龄26±2d,平均体重7.69±0.46kg),按照完全随机区组设计,5个处理组分别为阴性对照组(简称NC),阳性对照组(PC；每kg日粮中添加80mg的金霉素)；益生菌组(每kg饲料中分别添加5×108,10×108和25×108CFU的B. coagulans F5,简称L,M和H),周期21d。结果表明,组M在ADG和G/F上显著高于阴性对照NC(P<0.05),而组PC仅在G/F上高于组NC。在腹泻指标上,抗生素组PC,益生菌组M和H显著低于阴性对照组NC(P<0.05)。总菌DGGE及多样性分析表明,各组Shannon’s indexH’无显著差异(P>0.05),但是,数值上组L和M远高于组NC和PC。组之间无显著差异的原因是可能是个体差异较大。类群DGGE分析Lactobacillus表明,各组差异不大,出现在频率最高及条带相对密度最大是L. reuteri。Real-time PCR分析表明,PC组Lactobacillus的相对数量显著高于NC组,NC组E. coli相对数量显著高于抗生素组和益生菌组。(5)复合益生菌制剂160头仔猪(断奶日龄26±±2d,平均体重7.08±0.82kg),按照完全随机区组设计,分成4个处理组：阴性对照组(简称NC),阳性对照组(PC；每kg日粮中添加80mg的金霉素)；益生菌组M1(B. subtilis,20×108, E. faecalis5×108, E. faecium5×108, C. butyricum0.3×108CFU/kg饲料)及M2(B. subtilis20×108, E. faecalis1.25×108, B. coagulans5×108, C. butyricum0.3×108CFU/kg饲料)。实验分成2个阶段(phaseⅠ：d1to14和phaseⅡ：d15to28)。在整个阶段(d1to28),益生菌组M1和M2在ADG和G/F上显著高于组PC,组M2在G/F上显著高于其它3组,组PC和M1显著高于阴性对照组NC；而在腹泻率上,组NC和PC显著高于组M1和M2。粪便中乙酸,丙酸,丁酸及挥发性脂肪酸(VFA)在day14均无显著差异(P>0.05),而在day28差异显著(P<0.05)。组NC的乙酸及丙酸浓度显著高于其它各组(P<0.05)；抗生素组PC的丁酸浓度显著低于组NC；组NC的总VFA浓度显著高于组PC。DGGE分析表明,在phase Ⅰ,组M1和M2的Shannon’s index均为高于NC和PC,NC最低；在phase Ⅱ, NC组多样性指数略有升高,组PC指数最高,其次是组M2,最低为组M1；这些结果说明,复合益生菌可以促进断奶仔猪的生长,减少腹泻及粪便中乙酸和丙酸的含量。