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仔猪断奶腹泻(post-weaning Escherichia coli diarrhea,PWECD)是仔猪断奶后的常见病和多发病,其主要病原是携带K88和/或F18特异性菌毛的产肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)。利用ETEC特异性菌毛作为抗原免疫产蛋母鸡制备的抗PWECD特异性卵黄抗体(Egg-yolk antibodies,IgY),逐渐成为控制PWECD的研究热点。特异性IgY安全、高效,使用方便,且不诱导细菌产生耐药性,可避免由于抗菌药物使用造成的食品中的残留,也是一种非常有希望的抗生素替代品,在控制断奶仔猪腹泻中具有广阔应用前景。
本研究应用热抽提结合饱和硫酸盐沉淀法提取F18+ETEC分离株和标准株菌毛蛋白,探讨了F18菌毛蛋白弗氏佐剂苗作为抗原诱导产蛋母鸡生产F18菌毛特异性IgY对产蛋鸡的免疫原性及其合理免疫程序,并通过冻融法提取特异性:IgY、间接ELISA方法测定抗体效价,分析了F18菌毛特异IgY的消长规律及其对各种理化因素的稳定性,最后,通过体内和体外试验分别初步考察了F18菌毛特异性IgY对F18+ETEC的抑菌作用和预防仔猪腹泻的应用效果。主要研究结果如下:
通过PCR体外扩增和琼脂糖凝胶电泳、SDS-PAGE方法分析,仔猪断奶腹泻大肠杆菌分离株A20、D20鉴定为F18+ETEC;间接ELISA检测IgY效价,结果表明:无论标准株还是分离株,F18菌毛结合弗氏佐剂对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,能诱导母鸡产生高效价的抗体且能持续较长时间。但F18分离株免疫原性稍差于标准株,分离株免疫组卵黄抗体效价在高水平维持的时间相对较短。卵黄中抗体效价与血清中抗体效价基本持平行关系,相关系数在标准株为0.8042,在分离株为.7912。卵黄中抗体效价与血清中抗体效价差异显著(p＜0.05)。与血清中特异性抗体效价(最高可达1:51200)相比,卵黄中抗体效价稍低,但仍高达1:25600。
应用间接ELESA方法考察抗F18+ETEC IgY对温度、酸碱度、胃蛋白酶等各种理化因素的稳定性及乳糖、蔗糖对IgY活性的影响。结果表明:抗F18+ETECIgY热稳定性良好,60℃水浴30min效价无变化;对酸碱具有一定的耐受力,pH4.0～11.0环境中IgY活性改变不显著:经7次反复冻融和50％蔗糖处理,抗原结合活性也几乎未受损失;pH2.5时,该IgY对胃蛋白酶非常敏感,经胃蛋白酶37℃处理4h,效价从1:7200下降到1:100;37℃时经胃蛋白酶(pH4)和胰蛋白酶(pH7.5)分别处理4h,效价均无变化:30％蔗糖、50％蔗糖,10％乳糖、30％乳糖在胃蛋白酶处理时对F18+ETECIgY韵稳定性均略有保护作用。
采用喷雾干燥成功制备了高免全蛋粉。小白鼠急性毒性试验证明其属实际无毒物质。体外抑菌试验结果表明,抗体效价≥1:6400时,IgY能在37℃条件下8h内完全抑制F18+ETEC(菌液浓度为104cfu/ml)的生长繁殖,效价≤1:400时,F18+ETEC的生长几乎不受IgY影响;体内试验结果表明,攻毒前口服F18+ETEC特异性抗体组(下称IgY试验组)仅个别猪有一过性腹泻症状,而不用IgY对照组(下称空白对照组)仔猪腹泻严重且病程长达7d;粪便评分IgY试验组显著低于(p＜0.01)空白对照组;攻毒后IgY试验组排毒少于空白对照组,攻毒后第1、2、3、4d IgY试验组和空白对照组排毒率分别为40％、27％、20％、6.7％和27％、47％、33％、27％。另外,F18+ETEC特异性抗体还能有效提高仔猪增重,IgY试验组试验期内仔猪平均增重为1.713 kg,而空白对照组仅为0.132 kg;病理组织切片显示:IgY试验组仔猪小肠粘膜炎症反应较轻,绒毛形态基本正常,而空白对照组仔猪小肠粘膜炎症反应较明显,绒毛不完整,粘膜上皮细胞坏死,提示F18+ETEC特异性抗体蛋粉对小肠粘膜完整性也可提供有效保护。