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糖尿病(Diabetes mellitus DM)尤其是2型糖尿病(Type2 diabetes T2D)是一种具有高患病率和高疾病负担的代谢性疾病,目前受到了全世界范围内的广泛关注。大量的实验证据表明糖尿病与肥胖、胰岛素抵抗、慢性炎症反应等因素密切相关。随着对2型糖尿病及其相关代谢性疾病本质认识的不断深化,结果发现胰岛素抵抗(Insulin resistance IR)和慢性炎症反应是糖尿病、肥胖等代谢性疾病共同的病理基础,在糖尿病形成中发挥了重大的作用。肥胖和肥胖引起的脂质浸润、异位沉积是胰岛素抵抗、2型糖尿病、动脉粥样硬化共同的危险因素。脂肪细胞分化受损,脂质累积导致脂肪组织慢性炎症反应,从而引起前促炎因子如IL-6、TNF-α、IL-1β等分泌增加。这些分泌的炎症因子又进一步增强了局部炎症,促进了局部胰岛素抵抗,从而加速了2型糖尿病等代谢性疾病的发生发展。 人DEC1(differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1)在大鼠中称为SHARP2(splitand hairyrelatedprotein),小鼠中称为Stra13(stimulated with retinoicacid13),属于基本的螺旋环螺旋转录因子中的一个新亚群的成员。人DEC1广泛表达于大多数正常组织,包括软骨、肝脏、脂肪,也表达于一些肿瘤组织和肿瘤衍生的细胞株。DEC1与细胞分化,淋巴细胞的成熟,分子钟的调控,维持代谢的平衡均有关。当受到环境因素如低氧和细胞因子如IL-1β、IL-6刺激时DEC1表达显著提高,高脂饮食(High fat diet HFD)也可诱导DEC1表达,同时DEC1又反过来对代谢性核受体及相关代谢酶也具有调控作用,因此,DEC1与炎症反应密切相关,同时具有生理和代谢调控的意义。但是DEC1在2型糖尿病中的表达及分子机制未见明确的报道。因此我们建立了小鼠2型糖尿病模型,检测了肝脏中Stra13的表达,发现Stra13在2型糖尿病肝脏中明显增加,并伴随着小鼠体内炎症反应及脂质代谢紊乱。为了进一步探讨其机制,我们在体外培养小鼠原代肝细胞,模拟2型糖尿病(高糖高胰岛素)过程,发现Stra13表达增加,胰岛素能通过Akt/mTOR/HIF-1α通路浓度依赖性地诱导Stra13表达。 格列本脲属于钾通道关闭剂类磺酰脲药物,在临床上广泛应用于肥胖型2型糖尿病的治疗。研究显示其不仅能降低血糖,也能改善胰岛素抵抗、增加组织对胰岛素敏感性及抑制炎症反应,但其确切的机制仍不甚清楚。在本研究中给予2型糖尿病小鼠格列本脲10mg/kg灌胃预处理后发现,格列本脲能改善2型糖尿病脂质紊乱及炎症反应并同时降低Stra13(DEC1)表达。基于以上数据,我们假设格列本脲在改善2型糖尿病炎症及其相关的代谢紊乱时与Stra13表达有关。随后我们在小鼠原代肝细胞模拟高糖高胰岛素状态,发现格列本脲能抑制高糖高胰岛素诱导Stra13及相关炎症,脂质累积,钾通道开放剂未能逆转格列本脲的这种作用。HepG2细胞过表达DEC1,给予格列本脲发现格列本脲也能抑制DEC1所引起的炎症及脂质代谢紊乱,进-步证明格列本脲改善T2D脂质代谢紊乱及炎症反应与Stra13有关。 文章主要分为以下两部分: 第一部分:2型糖尿病小鼠中Stra13的表达及机制研究 第二部分:格列本脲通过Stra13改善小鼠肝脏炎症及脂质代谢紊乱 第一部分2型糖尿病小鼠中Stra13的表达及机制研究 目的:2型糖尿病已成为危害人类健康的重大疾病,患病人数达3亿之巨。胰岛素抵抗及慢性炎症是影响2型糖尿病及其并发症发生发展的重要因素。研究显示转录因子DEC1与炎症反应及脂质代谢密切相关。本部分的目的就是探讨2型糖尿病小鼠中S tra13的表达及其重要的分子机制。 方法:本部分实验整体水平研究2型糖尿病小鼠肝脏中Stra13的表达情况,离体水平在小鼠肝原代细胞的高糖情况研究胰岛素对于Stra13的表达及分子机制。 1)小鼠分为正常CON对照组及T2D模型组,正常饮食CON组给予正常低脂饮食12周,T2D组给予及高脂饮食12周并于第8周给予单次链脲佐菌素(STZ)40mg/kg注射,随后两组小鼠相应饮食继续喂养4周;小鼠处死前称体重,测空腹血糖血清水平;ELISA试剂盒检测炎症因子表达;提取肝脏RNA及蛋白,用RT-PCR、Western blot技术测定小鼠Stra13肝脏RNA及蛋白水平表达;Western blot方法检测Akt,mTOR,HIF-1α蛋白表达。 2)小鼠肝原代细胞在高糖DMEM条件下给予不同浓度胰岛素(1,10,100,1000nM)处理以及100nM胰岛素处理不同时间点(0,6,12,24h)收蛋白,检测Stra13蛋白表达及胰岛素信号通路蛋白表达;肝原代细胞预先给予Akt抑制剂(perifosine10μM)或mTOR蛋白抑制剂(雷帕霉素5nM),30min后再加入100nM胰岛素培养24h,检测Stra13及上游相关蛋白的表达;HepG2细胞给予shHIF-1α质粒转染及100nM胰岛素处理,检测DEC1表达。 结果:1)整体水平2型糖尿病小鼠体重水平,空腹血糖水平,空腹胰岛素水平均明显高于CON组(P<0.05);与CON组相比,肝脏中Stra13 mRNA及蛋白水平表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05);T2D小鼠肝脏中Akt,mTOR,HIF-1α蛋白表达增加(P<0.05)。 2)细胞水平胰岛素在高糖状况下显著诱导小鼠肝细胞Stra13表达,同时胰岛素信号通路蛋白Akt,mTOR,HIF-1α表达明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05);perifosine和雷帕霉素均能取消100nM胰岛素对Stra13的诱导作用;人肝癌细胞株HepG2细胞敲除HIF-1α后能取消胰岛素对于DEC1的诱导作用。 结论:2型糖尿病中Stra13表达增加,这与胰岛素信号通路激活相关。 第二部分格列本脲通过Stra13改善小鼠肝脏炎症及脂质代谢紊乱 目的:本文第一部分工作结果已经发现,在整体水平,2型糖尿病中胰岛素信号通路基因表达增加,诱导了Stra13的表达,同时伴随着2型糖尿病炎症因子增加及脂质代谢紊乱。格列本脲不仅能降低血糖,还能改善胰岛素抵抗及炎症,那么格列本脲抑制2型糖尿病的炎症反应,改善胰岛素敏感性与脂质积累是否是与Stra13有关,就是本部分的研究目的。 方法:1)整体实验,参照第一部分方法T2D模型组给予STZ注射后分为两组,加之正常低脂饮食对照组,共3组小鼠,即CON组、模型对照组(T2D)、模型给药干预组(T2D+Glib),模型干预组给予格列本脲10mg/kg灌胃给药4周;检测小鼠血清葡萄糖,血清甘油三酯胆固醇酯水平,油红O染色及HE染色检测肝脏及附睾脂肪组织脂质生成;提取肝脏及脂肪组织蛋白及RNA,用western blot及RT-PCR检测Stra13及脂质生成相关基因表达,ELISA方法检测血清炎症因子表达,Real-Time PCR检测肝脏中炎症因子的表达。 2)离体实验,小鼠原代肝细胞为模型,给予高糖高胰岛素的基础上给予不同浓度格列本脲处理(0,1,5,10μM),油红O染色检测肝原代细胞脂质表达,western blot检测脂质相关基因,炎症通路蛋白及Stra13表达;在小鼠原代肝细胞高糖高胰岛素状态下,给予二氮嗪50μM30min预处理,再给予格列本脲10μM干预,检测相关代谢基因及炎症基因表达;HepG2细胞过表达DEC1并同时给予格列本脲10μM检测脂质相关基因炎症相关蛋白表达。 结果:整体水平:格列本脲能抑制2型糖尿病中Stra13的表达,同时改善了炎症及脂质代谢紊乱,差异具有统计学意义(P<0.05);格列本脲干预降低了T2D小鼠肝脏ACC1、FAS、Srebp表达,促进了肝脏及脂肪Ces1d,Ces1e表达,差异具有统计学意义(P<0.05);格列本脲处理促进了脂肪组织Ces1d,Ces1e表达,差异具有统计学意义(P<0.05);格列本脲处理抑制了T2D小鼠肝脏炎症因子RNA水平表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。 离体细胞水平:细胞油红O染色结果显示,格列本脲处理能抑制肝原代小鼠细胞由高糖高胰岛素刺激引起的中性脂肪累积;RT-PCR及western blot结果显示,随格列本脲浓度增加肝细胞脂肪生成相关基因表达受抑制,脂质分解基因表达增加,且具有浓度依赖性,差异均具有统计学意义(P<0.05);50μM二氮嗪没有取消掉格列本脲对于脂质代谢及炎症基因的影响;HepG2细胞过表达DEC1实验显示格列本脲能抑制DEC1过表达诱导的细胞炎症及脂质累积基因表达。 结论:格列本脲通过降低Stra13改善2型糖尿病脂质代谢及炎症反应过程。